黑松露發(fā)酵液配方研制及實驗優(yōu)化

田園詩， 楊士春， 溫瀟雄， 張勁夫， 劉芮廷

（天津農(nóng)學院水利工程學院，天津300380）

0 引 言

黑松露中含有丁酸鹽、丙酸鹽，對巨噬細胞具有抗炎作用，能通過殺死水體中細菌、病毒的方式來凈化水體，黑松露中含有的葡聚糖在微咸水灌溉中能夠激活植株的抗氧化酶系統(tǒng)，減緩鹽離子脅迫，從而阻止根系損傷。因此探究黑松露發(fā)酵的最佳條件對水質(zhì)凈化和微咸水灌溉有著非常重要的意義［1-6］。

由于農(nóng)業(yè)上過量施用含有氮、磷、鉀等化肥、農(nóng)藥、糞尿等有機物及人畜腸道病原體，而普通復合肥的吸收利用率在30%左右，剩余的肥料會在土壤中被大量固定，從而使得土壤的化學性狀出現(xiàn)變化，導致土壤的供肥能力下降，用量大了也會加劇土壤鹽漬化［7-9］。如果忽略了中微量元素的施用，長期以往必會導致土壤養(yǎng)分失衡。若長期不補充有益微生物菌，土壤中有益微生物數(shù)量減少，導致土壤板結(jié)，根際環(huán)境惡劣，根系無法有效吸收土壤中的養(yǎng)分。劣質(zhì)糞肥的使用也會加重土壤鹽分積累。除此之外，長期使用大水漫灌澆水方式會對土壤造成壓實和淋洗的不良影響，抑制根系對養(yǎng)分的吸收，加重土壤鹽分濃度［10］。排灌設施老化不匹配，溝渠過淺，排水不暢，也會導致地下水位上升，導致鹽分積累，鹽漬化加劇［11］。

我國從上世紀70年代開始進行微咸水灌溉研究，證明微咸水灌溉相比旱作產(chǎn)量增加3～4倍［12］。試驗發(fā)現(xiàn)，增加1次微咸水灌溉或微咸水替代淡水灌溉，可以實現(xiàn)小麥穩(wěn)產(chǎn)或增產(chǎn)的效果，在輪灌與混灌處理下有壓堿壓鹽、作物增產(chǎn)的效果，利用微咸水灌溉與旱作相比產(chǎn)量較高［13］。用地下微咸水對灌溉小麥補充拔節(jié)水、灌漿水，產(chǎn)量達到淡水灌溉的90%。目前，國內(nèi)外黑松露的研究領域涵蓋了飲食、醫(yī)療、種植保健等方面，大部分研究者更專注于黑松露的種植研究，我國在黑松露上所做的研究已得到較大重視但仍有很多方面有待繼續(xù)研究補充，在通過黑松露在益生菌作用下發(fā)酵水溶液的特性變化的相關(guān)研究較少［14］。我國豐富的菌類產(chǎn)物有利于天然活性產(chǎn)物的研究。本文以黑松露發(fā)酵液的制備為研究出發(fā)點，希望對黑松露發(fā)酵液的配制及優(yōu)化，能為微咸水灌溉溶液的制備提供一個可行的參考。

1 實驗方案選用

1.1 分光光度計法

分光光度計法應用廣泛，儀器分辨率高，雜散光低，靈敏度高，穩(wěn)定性、可靠性強，分析準確，操作也比較簡便。步驟一般有：儀器預熱；旋動波長手輪，把所需波長對準刻度線；將裝有溶液的比色皿放置比色架中，令參比溶液置于光路；蓋上樣品室蓋，調(diào)節(jié)透光率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”；吸光度A的測量。儀器調(diào)T為0和100%后，將選擇開關(guān)轉(zhuǎn)換至A調(diào)零旋鈕，數(shù)字顯示應為“.000”。然后拉出拉桿，使被測溶液置入光路，數(shù)字顯示值即為試樣的吸光度A；測定完畢后，先打開樣品室蓋，再斷電源，比色杯應清洗干凈后，再貯放保存；濃度直讀按MODE鍵，使CONC批示燈亮，交已標定濃度的溶液移入光路，按下溶液調(diào)節(jié)鍵（↑100%T鍵的↓0%鍵），使數(shù)字顯示為標定值，將被測溶液移入光路，即讀出相應濃度值；儀器數(shù)字顯示背后，裝有接線柱，按下FUNC鍵，可輸出模擬信號。

1.2 對照實驗法

對照試驗是檢定測定方法是否存在系統(tǒng)誤差的方法之一。對照試驗一般分為以下幾步：首先，根據(jù)實驗目的和變量對實驗材料以及用具分組，應注意每組除所探究的實驗材料外，其他條件全部相同；其次，對各組進行不同實驗變量處理，施加實驗變量的組為實驗組，不施加實驗變量的組為對照組，應注意合理設計對照試驗以及正確處理實驗變量；最后，在其他條件都相同的條件下，培養(yǎng)一段相同的時間，觀察并記錄實驗結(jié)果，分析不同實驗變量對實驗結(jié)果造成的不同影響，應注意控制好無關(guān)變量，保證實驗遵循單一變量原則。

2 實驗條件分析

2.1 黑松露發(fā)酵粉中葡聚糖含量測定

2.1.1 黑松露搖瓶發(fā)酵液氣相色譜分析

（1）錐形瓶清洗、消毒、滅菌。用洗滌劑將三角瓶里外清洗一遍，沖去泡沫，再往瓶里注入蒸餾水放入鍋里在電磁爐上煮沸并重復3次，最后把三角瓶里的水倒凈，放入烤箱，溫度調(diào)到108℃，溫度恒定后取出備用。

（2）用臼式研磨儀把黑松露片研磨成粉末。

（3）用電子秤稱取1 g研磨好的黑松露粉末，共25次，分別用藥匙移入25個錐形瓶中，編號依次為1～25。

（4）用移液管取2 mL姬松茸菌種24次，分別加入到編號為1～24的錐形瓶中，再用量筒量取10 mL培養(yǎng)基12次，分別加入到編號為1～12的錐形瓶中，最后用量筒量取30 mL蒸餾水加入到編號為1～25的錐形瓶中。

（5）用棉塞對上述編號1～25的錐形瓶進行封口，防止外界微生物進入，保持三角瓶內(nèi)部無菌狀態(tài)。

（6）把編號的三角瓶放到同一搖床中，參數(shù)設定為：溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，時間24 h。

（7）經(jīng)過24，48、72、96、120，144 h對搖床中的樣品逐一取樣，每天取4個樣，分別為該時段加入培養(yǎng)基和不加培養(yǎng)基的各2個，編號為25的錐形瓶在144 h下進行取樣。具體操作為：用去掉針頭的一次性注射器從三角瓶中取出發(fā)酵液，放入5 mL容量瓶中，再把容量瓶放入離心機離心沉淀15 min。離心結(jié)束后給注射器安上孔徑為0.22μm的過濾嘴，使上清液過濾到2.0 mL的容量瓶中，編號與之前對應，蓋好蓋子。

（8）通過使用分光光度計在510 nm吸光度下對黑松露發(fā)酵粉樣品進行測量、分析、計算，得：葡聚糖2.52 ng/kg，超氧化物歧化酶活性60.8 U/g，中性蛋白酶活性55 U/g。

2.1.2 黑松露發(fā)酵粉中葡聚糖含量的測定結(jié)果分析

葡聚糖作為一種多糖，存在于某些微生物中。黑松露發(fā)酵粉中含有葡聚糖含量為25.2 ng/g，超氧化物歧化酶活性為60.8 U/g。葡聚糖能激活植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，對超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等這些抗氧化酶的活性有激活作用，且激活植物體內(nèi)的酶抗氧化活性比體外補充相同等量的酶的活性高成百倍上千倍。被激活的超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，可以使細胞較有效地清除H2O2等強氧化劑。在微咸水灌溉中，葡聚糖通過激活超氧化物歧化酶的活性，減緩微咸水中鹽脅迫對植物根部的膜質(zhì)過氧化作用，使植物通氣組織和根部的抗氧化能力得到改善，提高了植物對水分的吸收量，緩解了微咸水灌溉造成的滲透脅迫（滲透脅迫表現(xiàn)為植株根系周圍土壤鹽分過高，根系滲透吸水困難，植株水勢下降，造成生理干旱）。可以利用葡聚糖開發(fā)一種新型的植物肥料，既可以解決微咸水灌溉中含鹽量高造成的土壤積鹽，影響作物對水分的吸收造成的減產(chǎn)的問題，又可以避免大量使用氮肥、鉀肥、磷肥來提高抗氧化酶系統(tǒng)后造成的水體富營養(yǎng)化。

2.2 黑松露發(fā)酵粉中酸含量測定

2.2.1 黑松露發(fā)酵粉中酸含量

由已知實驗標樣得到各種酸和醇的線性方程如圖1所示。據(jù)丁酸、異丁酸、丙酸、乙酸、異戊酸、正庚酸、正己酸的線性方程和酸隨響應值變化，得到各種酸含量如表2～4所示。

圖1 黑松露發(fā)醇粉中酸和醇的線性方程

表2 丁酸、異丁酸、戊酸含量計算表

表3 異戊酸、乙醇、乙酸含量計算表

2.2.2 黑松露搖瓶實驗

為了能夠提高數(shù)據(jù)的準確性和更直觀地看出各個時間段各種發(fā)酵產(chǎn)物的變化，取兩組平行實驗的濃度平均值作為最終濃度，具體濃度如表5所示。

表5 表乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸異、戊酸、己酸平均濃度 ng/kg

表4 丙酸、己酸、庚酸含量計算表

從表5可以得出，加入培養(yǎng)基和菌種情況下，乙醇濃度最高，總濃度為27 388.282 g/L；各種酸中丁酸的濃度最高，總濃度為352.743 mg/L，戊酸濃度最低（總濃度為除時間外其他條件相同下的總和）。

2.2.3 實驗結(jié)果分析

從表5中可以看出，在加入培養(yǎng)基的條件下除異丁酸外產(chǎn)生的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、己酸之和都比未加入培養(yǎng)基條件下要多，且加入培養(yǎng)基條件下產(chǎn)生的各種脂肪酸的總和也大于未加入培養(yǎng)基條件下產(chǎn)生的脂肪酸的總和。分析可以得出：培養(yǎng)基能促進酵母菌生長、繁殖，所以增加了乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、己酸的含量。

由表5中分析可得，黑松露發(fā)酵液產(chǎn)生的丁酸、乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸、己酸在加入培養(yǎng)基的條件下地最佳發(fā)酵時間為72、24、72、48、144、96、48 h，黑松露發(fā)酵液產(chǎn)生的丁酸、乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、己酸在未加入培養(yǎng)基的條件下地最佳發(fā)酵時間為24、144、144、48、144、24 h；所以不同的發(fā)酵條件有不同的最佳發(fā)酵時間。

綜上所述，在發(fā)酵時間為72 h，加入培養(yǎng)基和菌種的條件下能產(chǎn)生更多的脂肪酸，尤其是丁酸和丙酸，該條件下丁酸含量為130.644μg/kg。脂肪酸能夠抑制促炎性細胞的產(chǎn)生和分泌，同時刺激生產(chǎn)和生產(chǎn)釋放抗炎細胞因子，這些細胞因子在炎癥細胞中的基因表達的修飾由丙酸和丁酸的組蛋白乙酰酶抑制活性引起［15］。國外研究顯示病毒普遍存在于各種水體中，例如：江、河、湖、海、地下水，乃至經(jīng)過凈化處理過的自來水都含有一定量的病毒和細菌，國內(nèi)有研究人員檢測了渤海中地污染情況，檢測發(fā)現(xiàn)海水中的腸道病毒濃度范圍為6.3～1.7 mg/L，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒在北京水源水中的檢出率為34.6%［16］。丁酸鹽和丙酸鹽能殺死水體中的細菌與病毒，對水體有凈化作用，讓人們喝到安全健康的水。

3 結(jié) 語

本文通過黑松露在不同發(fā)酵條件下發(fā)酵實驗并借助氣相色譜儀對黑松露發(fā)酵粉、黑松露發(fā)酵液脂肪酸特性及黑松露地最佳發(fā)酵條件進行了研究；借助分光光度計對黑松露中的葡聚糖含量進行研究。

為了使黑松露發(fā)酵得到更多的丁酸鹽和丙酸鹽來凈化水體，則它的發(fā)酵條件為同時加入菌種和培養(yǎng)基在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min下發(fā)酵72 h。

黑松露發(fā)酵粉中丁酸含量為86 ng/kg，通過搖瓶發(fā)酵之后黑松露發(fā)酵液中丁酸含量為130.644μg/kg，黑松露發(fā)酵產(chǎn)生的大量丁酸鹽，可以改善水質(zhì)，優(yōu)化水體環(huán)境，這是一種優(yōu)化水體的天然原料。

黑松露發(fā)酵粉中葡聚糖的含量為2.52 ng/kg，葡聚糖能激活植物體內(nèi)氧化物歧化酶的活性，在灌溉中能減緩微咸水中鹽脅迫對植物根部的膜質(zhì)過氧化作用，增加植物的抗鹽能力，由此可以利用葡聚糖開發(fā)一種新型植物肥料，可以避免氮肥、鉀肥、磷肥等避免造成的水體富營養(yǎng)化。

黑松露發(fā)酵液在180℃下噴霧干燥后，丁酸含量不變，說明用黑松露發(fā)酵液在180℃下噴霧干燥為發(fā)酵粉這個濃縮方法是可行的。鑒于黑松露發(fā)酵粉與發(fā)酵液相比有著易于保存，不易變質(zhì)的特點，可以用噴霧干燥法把黑松露發(fā)酵液轉(zhuǎn)化為黑松露發(fā)酵粉作為制作新型凈水劑的原料。