防控煙草青枯病植物免疫誘抗劑的篩選及其防治效果測定

薛 梅，曾婉琳，張 榮,2，馮淑杰,2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學廣東省群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳病害，是世界范圍內(nèi)最重要的植物毀滅性病害之一［1-2］。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，煙株一旦被青枯病感染，將會嚴重影響煙葉的產(chǎn)質(zhì)量，甚至造成整株死亡，對煙草帶來毀滅性的損失［1,3-5］。由于青枯病侵染煙草造成的損失居各類煙草侵染性病害第4 位［6］，該病害已成為制約煙草安全健康發(fā)展的重要障礙。因此，尋求有效的煙草青枯病防治措施一直受到研究者的關(guān)注［7］。而在目前我國大力提倡農(nóng)藥減施的前提下，探索有效且對環(huán)境安全友好的青枯病防控措施顯得尤為必要。

【前人研究進展】植物的誘導(dǎo)免疫抗性，是指充分利用植物自身對病害發(fā)生的潛在控制能力，通過調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)、代謝系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，延遲或減輕病害發(fā)生和發(fā)展的一種特性［8］。植物免疫誘抗劑，也叫植物疫苗，利用誘導(dǎo)因子激發(fā)出植物這種潛在的對病害的抗病性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶（POD）等的反應(yīng)、病程相關(guān)蛋白（PR）的調(diào)控與表達以及抗病物質(zhì)的變化，從而防控植物病害的發(fā)生［9］。因此植物免疫誘抗劑是生物防治中一類新型的環(huán)保型植物保護劑，符合我國發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的要求［10-15］。近年來，在煙草青枯病防治上也對植物免疫誘抗劑的應(yīng)用進行了探索。陳澤鵬等［16］研究發(fā)現(xiàn)誘抗劑苯并噻二唑（BTH）對煙草誘導(dǎo)抗病具有顯著效應(yīng)，抗病效率為52.76%。王志愿［17］研究發(fā)現(xiàn)誘抗劑殼聚糖（CTS）對煙草青枯病的防控效果達81.17%。蔣承耿等［18］研究發(fā)現(xiàn)0.136%赤·吲乙·蕓薹可濕性粉劑10 000 倍液處理對煙草青枯病的誘抗效果可達78.02%。韓松庭等［19］將2,6-二氯異煙酸與多粘類芽孢桿菌聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)其對青枯病的防控效果顯著高于其他處理。

【本研究切入點】目前煙草青枯病的防治主要包括抗病性品種的種植、農(nóng)業(yè)防治措施、生物防治措施、化學防治措施、綜合防治措施以及利用土壤添加劑防治等一系列方式［7,20］，但在很大程度上仍傾向于化學防治。而化學藥劑不僅易使青枯病菌產(chǎn)生耐藥性，對土壤和水體等都有嚴重危害，而農(nóng)業(yè)防治操作困難，在防治方式選擇上只能作為輔助措施。因此，具有無污染、不易產(chǎn)生抗性、對人畜安全等優(yōu)點的生物防治成為防治青枯病的研究熱點［6,21-22］。植物免疫誘抗劑具有預(yù)防性、系統(tǒng)性、穩(wěn)定性、相對性、安全性等一系列優(yōu)點，利用植物天然免疫系統(tǒng)防治病蟲害，從源頭上減少農(nóng)藥對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染，更符合當今農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對不同來源的植物免疫誘抗劑智能聰、阿泰靈、氨基寡糖素，以及納米材料NANO ZnO 進行平板抑菌測定和盆栽試驗，選擇出對煙草青枯病有顯著防治效果的誘抗劑，以達到煙草病害防治中減藥的目的，為煙草青枯病的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草青枯病菌（R.solanacearum）菌株203，為廣東省煙草產(chǎn)區(qū)分離的強致病力菌株；供試煙草品種為普通煙草（Nicotiana tabacumL.）K-326，為目前廣東煙葉生產(chǎn)中的主栽品種，對青枯病菌抗性表現(xiàn)為中抗。

智能聰（1 mg/g，粉劑），由山東蓬勃生物科技有限公司提供；阿泰靈（6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑），購自中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊農(nóng)藥中試廠；0.5%氨基寡糖素水劑，購自成都新朝陽作物科學有限公司；納米材料NANO ZnO，由華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃雪梅副教授提供；90%農(nóng)用鏈霉素購自鄭州聯(lián)農(nóng)瑞豐德科技有限公司；分析純鏈霉素購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同植物免疫誘抗劑對煙草青枯菌的平板抑制作用 采用抑菌圈法進行平板抑制試驗。吸取2 mL 預(yù)先備好的青枯菌液（OD600=0.1）加入30 mL 的NA 培養(yǎng)基中，混勻倒平板。凝固后用打孔器將每個皿培養(yǎng)基打出呈三角形分布的3 個孔。每孔注入20 μL 不同濃度的供試藥劑。30 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)十字交叉法測量抑菌圈大小。以不加藥劑為空白對照，以不同濃度鏈霉素處理為陽性對照，每個處理3 次重復(fù)。試驗重復(fù)2 次。各植物誘抗劑濃度設(shè)置見表1。

表1 抑菌圈法中各植物免疫誘抗劑供試濃度Table 1 Test concentration of each plant immune inducers in the inhibition method

1.2.2 不同植物免疫誘抗劑最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定 為進一步了解供試藥劑的抑菌作用，對其進行MIC、MBC 測定。根據(jù)抑菌試驗結(jié)果，設(shè)置供試藥劑的3 個初始濃度：智能聰10、5、2.5 μg/mL，阿泰靈6、3、1.5 μg/mL，氨基寡糖素2 000、1 000、500 μg/mL，陽性對照鏈霉素6.675、3.3375、1.66875 μg/mL。

然后將1 mL OD600=0.3～0.4 的青枯菌液和藥劑混合，加入NB 培養(yǎng)基至20 mL。30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，菌液透明澄清時所對應(yīng)的藥液濃度即為MIC。MBC 根據(jù)MIC 的測定結(jié)果，選取1MIC、2MIC 和4MIC 對應(yīng)樣品的菌液，吸取20 μL 在NA 平板上涂布，30 ℃培養(yǎng)12 h，無菌落生長的最低藥物濃度即為MBC。試驗重復(fù)2 次。

1.2.3 不同植物免疫誘抗劑防治煙草青枯病的盆栽試驗 將0.1 μg/mL 智能聰、3 μg/mL 氨基寡糖素、150 μg/mL 納米和8 μg/mL 阿泰靈的水溶液分別與滅菌后的田園土、基質(zhì)均勻，培育煙草苗，移栽后15 d 澆灌相應(yīng)誘抗劑20 mL，每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)10 株，對照澆清水。移栽后40 d 采用灌根法［23］接種20 mL/株的OD600=0.3～0.4 的青枯菌液，放置于30 ℃條件下，8 h/12 h 光暗交替處理，定期觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)，并計算防治效果。試驗重復(fù)3 次。

病害調(diào)查參照國家煙草專賣局發(fā)布的煙草病害分級及調(diào)查方法（YC/T）39-1996 進行。煙草青枯病病按5 級分級標準調(diào)查病害嚴重度：0 級：全株無??；1 級：莖部偶有褪綠斑，或在有條斑一側(cè)有少數(shù)葉片凋萎；2 級：莖部有黑色條斑，但尚未達到頂部，或病側(cè)半數(shù)以上葉片凋萎；3 級：莖部黑色條斑到達植株頂部，或病側(cè)2/3 以上葉片凋萎；4 級：病株基本枯死。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS（21.0）進行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物免疫誘抗劑對煙草青枯菌的平板抑菌測定

4 種供試誘抗劑和陽性對照鏈霉素對煙草青枯菌生長表現(xiàn)了不同的抑制效果。其中，高濃度的氨基寡糖素和納米材料及陽性對照鏈霉素表現(xiàn)了直接的抑菌效果，而不同濃度的智能聰和阿泰靈均沒有顯示對青枯病菌的抑制作用。抑制效果最明顯的為5 000 μg/mL 氨基寡糖素水劑，抑菌圈半徑高達35.2 mm（圖1A1），其次是8 000 μg/mL 的納米材料，抑菌圈半徑為20.5 mm（圖1B1）；隨著供試濃度的降低，氨基寡糖素和納米材料抑菌效果明顯降低，50 μg/mL 氨基寡糖素基本不會產(chǎn)生抑菌圈（圖1A3），而80 μg/mL 納米材料僅有5.8 mm 的微弱抑菌圈；陽性對照鏈霉素的抑菌效果在測試范圍內(nèi)都較為穩(wěn)定。

圖1 氨基寡糖素水劑、納米材料、鏈霉素對煙草青枯菌的平板抑菌試驗Fig.1 Plate antibacterial experiment of amino- oligosaccharin,NANO ZnO and streptomycin against Ralstonia solanacearum

2.2 不同植物免疫誘抗劑最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

在供試藥劑中，氨基寡糖素和鏈霉素對煙草青枯菌表現(xiàn)了較強抑菌效果。其中氨基寡糖素的MIC值為10 000 μg/mL，MBC值為20 000 μg/mL；鏈霉素的MIC值為6.675 μg/mL，MBC值為13.35 μg/mL。而在有效供試濃度內(nèi)，智能聰、阿泰靈各濃度對應(yīng)的菌液變渾濁，均沒有測到MIC。進一步說明這2種藥劑對煙草青枯病菌沒有直接的抑菌作用。

2.3 不同植物免疫誘抗劑防治煙草青枯病的盆栽試驗

盆栽防治試驗結(jié)果（表2）顯示，智能聰、阿泰靈和氨基寡糖素對煙草青枯病的發(fā)生均具有一定的防治效果，在整個發(fā)病過程中，各處理病情指數(shù)始終低于對照。其中，誘抗劑智能聰對煙草青枯病的防治效果最好，且可以延緩病害的發(fā)生1～2 d，其防治效果始終優(yōu)于鏈霉素處理。如接種后10 d，智能聰防效為57%，顯著優(yōu)于鏈霉素處理的37%防效，而阿泰靈、氨基寡糖素對煙草青枯病的防治效果較差，防效僅為15%、13%；納米NANO ZnO 的防治效果最差，在病害發(fā)生早期，病情指數(shù)與對照無顯著差異。

表2 不同藥劑處理對煙草青枯病發(fā)生的防治效果Table 2 Control effect of different agent treatments on tobacco bacterial wilt

3 討論

植物免疫誘抗劑作為一種新型的生物防治制劑，不僅能有效防治病蟲害，還能提高作物產(chǎn)量，對植物的抗逆功能也有提高作用［24］，因此在煙草病害的綜合防治中越來越受到重視［25］。智能聰是從野生沙刺內(nèi)生菌宛氏擬青霉菌（Paecilomyces variotii）中提取的一種高效環(huán)保的新型免疫誘抗劑，具有促進植物生長、提升抗病等抗逆能力、增加產(chǎn)量等作用［26］。郭梅燕等［27］報道了智能聰對煙草病毒病表現(xiàn)出良好防效，且可以減輕根莖類病害和后期葉斑類病害的發(fā)生程度，其中以500 ng/mL 智能聰抗病毒病、赤星病等病害的效果最好，抗病毒效果可達57.07%。本研究中，不同濃度植物誘抗劑智能聰對煙草青枯病菌沒有顯示直接的抑菌作用，而在盆栽試驗中0.1 μg/mL 智能聰能夠延緩煙草青枯病的發(fā)生，且對煙草青枯病起到較好的防治作用，其防治效果高于鏈霉素。這可能是因為智能聰預(yù)處理煙草苗后，在接種青枯菌之前激活了煙草自身的免疫代謝系統(tǒng)，不僅誘導(dǎo)相關(guān)防御酶活性的提高，還激活抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達，生理和分子同時調(diào)控煙株的抗性，使煙株獲得抵御病害的能力［26,28］。因此，智能聰可作為取代或部分取代煙草青枯病防治所需化學藥劑的參考藥劑。

氨基寡糖素也稱為農(nóng)業(yè)專業(yè)殼寡糖，是從海洋生物外殼提取而來的多糖類天然產(chǎn)物［29］。很多研究表明，氨基寡糖素對煙草普通花葉病毒病的抑制效果明顯。蘇小記等［30］研究報道2.0% 氨基寡糖素水劑連續(xù)噴施3～4 次對煙草病毒病的防效達到72.4%～77.9%。羅剛等［31］發(fā)現(xiàn)氨基寡糖素和鉀營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑（肥萬鉀）配施能有效降低煙株普通花葉病毒病的發(fā)病率和病情指數(shù)，并以兩次防治后的降幅最大，防治效果明顯，兩點的平均防效達到56.31%，大大減輕了普通花葉病對煙葉生產(chǎn)的危害。目前關(guān)于氨基寡糖素對煙草青枯病作用效果的報道仍然較少。本研究在平板對峙試驗中，高濃度的氨基寡糖素對煙草青枯病菌有顯著抑制作用，而該濃度遠高于其大田使用濃度，參考意義不大；在盆栽防效試驗中，其對煙草青枯病的防治效果較差。

阿泰靈是世界上首個研制出來的植物免疫蛋白質(zhì)的生物農(nóng)藥，為3%氨基寡糖素和3%極細鏈格孢激活蛋白組成的復(fù)合制劑，充分利用了兩種成分的相互增效作用，誘導(dǎo)作物多重反應(yīng)，調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系，改善作物品質(zhì)，刺激作物生長，達到作物增產(chǎn)增收的效果［9］。然而，本研究的平板測定和盆栽試驗中，阿泰靈均沒有顯示出抑菌和良好的防病效果，但明顯地促進植物生長（數(shù)據(jù)未列出）；而NANO ZnO 則表現(xiàn)為高濃度時對煙草青枯病菌有一定的抑制作用（但此濃度并不適合用于植物處理），而在盆栽防效試驗中，其對煙草青枯病幾乎沒有防治效果，但明顯地促進植物生長（數(shù)據(jù)未列出）。這也進一步說明不同誘抗劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的機理并不相同，不同的處理時期、處理方法或處理濃度可能都會存在差異。因此，想要挖掘更多、更有效的誘抗劑，尚需更多的試驗去完善，也需要進一步對其誘導(dǎo)植物抗性產(chǎn)生的分子機理進行探索。

4 結(jié)論

煙草青枯病屬于細菌性土傳病害，寄主范圍廣，防治困難，煙株一旦被侵染，極易造成毀滅性損失，嚴重影響煙業(yè)的產(chǎn)質(zhì)量。本試驗通過平板對峙聯(lián)合盆栽防效試驗篩選到對煙草青枯病有顯著防控作用的一種植物免疫誘抗劑智能聰。在育苗前利用適宜濃度智能聰拌種，待移栽成活后采用灌根法澆灌智能聰于煙株根部，可誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生抗性，延緩病害發(fā)生，在接種青枯病菌后10 d 對煙草青枯病的防治效果可達57%，優(yōu)于鏈霉素處理，因此可用于煙草青枯病的綠色防控，并在一定程度上可作為取代或部分取代化學藥劑的參考藥劑進行使用。