甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌分離鑒定及藥劑篩選試驗(yàn)

崔一平，彭埃天，凌金鋒，宋曉兵，程保平，陳 霞

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】甘蔗（Saccharum offi cinarumL.）是世界上重要的糖料作物及有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕茉醋魑铮覈?guó)是世界上最大的甘蔗生產(chǎn)國(guó)之一［1］。近些年來(lái)，我國(guó)蔗糖產(chǎn)量和食糖消費(fèi)量已經(jīng)躍居世界第3 位［2］。在我國(guó)，甘蔗種植面積占糖料種植面積的85%以上，產(chǎn)糖量占食糖總產(chǎn)量的90%以上［3-5］。廣東省是繼廣西和云南之后的我國(guó)第三大蔗區(qū)，90%左右的植蔗區(qū)位于粵西地區(qū)，珠三角、粵北地區(qū)和粵東地區(qū)也有零星種植［6］；其中粵西地區(qū)主要以種植糖蔗為主，粵東地區(qū)則以種植果蔗為主。甘蔗作為用蔗莖腋芽進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物，甘蔗種苗是傳播甘蔗病害的主要媒介。因此，及時(shí)科學(xué)診斷出新的甘蔗種傳病害并提出具體的防治藥劑，有利于增強(qiáng)甘蔗的種苗安全，對(duì)提高甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)有重大的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在我國(guó)，甘蔗上報(bào)道的病害如甘蔗黑穗病、甘蔗花葉病、甘蔗宿根矮化病、甘蔗黃葉綜合征和甘蔗鳳梨病等大約有50 多種，這些病害大多數(shù)都能夠通過(guò)種苗進(jìn)行傳播［7-9］。同時(shí)，由于蔗區(qū)之間引種頻繁、蔗種相互調(diào)換，缺乏檢測(cè)，使得一些嚴(yán)重病害在甘蔗種植區(qū)造成了嚴(yán)重為害，如印度，赤腐病已經(jīng)對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性的打擊［10］。近年來(lái)，越來(lái)越多的新病害在我國(guó)不同的蔗區(qū)被報(bào)道，如由Fusarium sacchari引起的甘蔗萎蔫病，F(xiàn)usarium commune引起的甘蔗根腐病，Alternaria tenuissima引起的甘蔗葉片白條病等等［11-13］。這些新病害的出現(xiàn)極大增加了甘蔗病害防治的難度，給不同種植區(qū)間甘蔗的引種增加了風(fēng)險(xiǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘蔗黑斑霉葉條病為本課題組2016 年和2017 年在廣東省廣州市南沙區(qū)田間的黑皮果蔗上發(fā)現(xiàn)，病害初期在甘蔗幼嫩葉片的葉緣上出現(xiàn)黃色到白色的條狀病斑，而后逐漸向葉片的中脈進(jìn)行擴(kuò)展；發(fā)展到后期嚴(yán)重的時(shí)候，從葉鞘外可看到粉色的水漬狀病斑，葉鞘的顏色由淡綠色變?yōu)榉凵?。?jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘蔗黑斑霉葉條病在甘蔗的苗期到成株期均可發(fā)生危害；一旦環(huán)境合適，在苗期甘蔗黑斑霉葉條病可造成甘蔗植株的大面積干枯死亡；而在甘蔗生長(zhǎng)的后期發(fā)病，則會(huì)造成甘蔗頂梢葉片的大量枯死，從而嚴(yán)重影響甘蔗的光合作用，造成甘蔗糖分積累的大量減少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究著重對(duì)引起甘蔗黑斑霉葉條病病原菌Nigrospora sphaerica進(jìn)行分離鑒定，同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)溫度、pH、檢測(cè)及化學(xué)藥劑防治進(jìn)行研究和篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：感病和健康的黑皮果蔗于2017年采集自廣州市南沙的甘蔗種植地（種植面積為5 153.3 hm2）。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 000 mL）。

試劑及儀器：Axygen 動(dòng)植物基因組DNA制備試劑盒，愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye），北京全式金生物技術(shù)有限公司；研究中用到的引物合成及PCR 產(chǎn)物測(cè)序服務(wù)均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；1 mol/L NaOH（4 g NaOH 加入到100 mL 水中），1 mol/L HCl（1 mL 37%濃鹽酸加入到11 mL 水中）。美國(guó)貝克曼Microfuge 20 微量離心機(jī)、T100TM PCR 儀及美國(guó)伯樂(lè)1704487 小型水平電泳槽均購(gòu)自上海凌儀生物科技有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Leica DM2500 光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica 公司。

化學(xué)藥劑：施保功（Sporgon），為丙氯靈prochloraz 和氯化錳復(fù)合制成的50%可濕性粉劑，德國(guó)先靈農(nóng)業(yè)化學(xué)有限公司獨(dú)立開(kāi)發(fā)的咪唑類(lèi)廣譜性殺菌劑，對(duì)子囊菌引起的各種作物病害有特效。苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole），別名世高，有多種劑型，內(nèi)吸性殺菌，具保護(hù)和治療作用，對(duì)很多作物上的真菌病害都有保護(hù)和治療作用。苯甲·福美雙，為苯醚甲環(huán)唑和福美雙進(jìn)行有機(jī)配合制成的60%可濕性粉劑，由山東東泰農(nóng)化有限公司研發(fā)制成，對(duì)水稻、煙草和蔬菜等真菌性病害有特效。咪鮮胺（Prochloraz），是一種廣譜殺菌劑，需避光保存，是德國(guó)艾格福公司（現(xiàn)為拜耳公司）于1977 年開(kāi)發(fā)的咪唑類(lèi)廣譜性殺菌劑，對(duì)多種作物由子囊菌和半知菌引起的病害具有明顯的防效，也可以與大多數(shù)殺菌劑、殺蟲(chóng)劑、除草劑混用，均有較好的防治效果。50%丙環(huán)唑，是一種廣譜、內(nèi)吸性的葉面殺菌劑，由江西正邦生物化工股份有限公司研制，對(duì)水稻和小麥紋枯病、香蕉黑星病、水稻稻曲病等都有良好防效。噻唑鋅，購(gòu)自浙江新農(nóng)化工股份有限公司，為懸浮劑，對(duì)細(xì)菌性病害特效，對(duì)多種真菌性病害高效。噁霉靈（hymexazol），為內(nèi)吸性殺菌劑、土壤消毒劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，購(gòu)自北京為民生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離及形態(tài)特征觀察 選取感病的黑皮甘蔗葉片和葉鞘，用剪刀在病健交界處剪出0.2 mm×0.2 mm 左右的正方形小塊，然后依次在70%酒精中放置30 s,2%NaClO 1.5～2 min，無(wú)菌水沖洗4 次，置于無(wú)菌濾紙上在超凈臺(tái)中晾干，最后放置于PDA 培養(yǎng)基上25 ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)。

1.2.2 致病性測(cè)定 選取在PDA 上培養(yǎng)7 d 的分離菌株,菌絲塊大小為5 mm×5 mm，分別接種于帶有傷口的1 月齡甘蔗苗上；同時(shí)以相同的PDA培養(yǎng)基塊接種于帶傷口的黑皮甘蔗莖稈上，作為陰性對(duì)照。

采集健康和發(fā)病的甘蔗作為種子，分別種植于已滅菌的土壤中，放置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)（光照/黑暗：12 h/12 h；濕度：40%）；正常肥水管理，20 d 后觀察甘蔗苗的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定 將培養(yǎng)7 d的分離菌株菌絲從PDA平板上刮下來(lái)，迅速用液氮研磨。然后依據(jù)Axygen動(dòng)植物基因組DNA制備試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。選取核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的檢測(cè)引物（ITS1：5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'– TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［14］，分別以分離菌株的全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，將獲得的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。對(duì)獲得的片段核酸信息在NCBI中進(jìn)行BLAST并把相關(guān)數(shù)據(jù)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)利用MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大似然法建立進(jìn)化樹(shù)，從而確定該分離菌株的分類(lèi)地位。

1.2.4 甘蔗組織DNA 的提取 稱(chēng)取新鮮組織 4～5 g，剪碎放入研缽中，用液氮研磨成粉末；將粉末轉(zhuǎn)移到已滅菌的2 mL 離心管中，根據(jù)Axygen 動(dòng)植物基因組DNA 制備試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)所獲DNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 甘蔗黑孢霉葉斑病的檢測(cè) 根據(jù)以ITS1/ITS4 為引物，甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌N.sphaerica的D N A 為模板，擴(kuò)增獲得的ITS序列設(shè)計(jì)特異性的檢測(cè)引物。通過(guò)NCBI的Primer-blast設(shè)計(jì)2對(duì)引物；Ns1F:5-TGTACCTGCGGAGGGATCAT-3和Ns2R:5-CCTGATCCGAGGTCAACCAG-3,PCR產(chǎn)物為501 bp；Ns2F:5-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3和Ns2R：5-ACTACGCTCAG AGGACTGCT-2，PCR產(chǎn)物為206 bp。分別以采集自田間發(fā)病植株的葉片和葉鞘，人工接種發(fā)病植株的葉片以及N.sphaerica菌落的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)流程為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)；同時(shí)將獲得的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序，確定擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。

1.2.6 菌株S2-1 生物學(xué)特性的測(cè)定 溫度對(duì)菌株S2-1 菌絲生長(zhǎng)的影響：在單胞培養(yǎng)7 d 的N.sphaerica菌落上，用滅菌打孔器取直徑5 mm的菌餅分別接種在PDA 平板中央，每塊平板上放1 個(gè)，分別放在5、10、15、20、25、30 ℃培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理3 次重復(fù)。同時(shí)，分別在接種后1、2、3、4 d 用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑并記錄。

pH 對(duì)S2-1 菌絲生長(zhǎng)的影響：用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 分別調(diào)節(jié)滅菌的PDA 培養(yǎng)基，pH 分別調(diào)節(jié)為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9。取單胞培養(yǎng)7 d 的N.sphaerica菌落上直徑5 mm 的菌餅，分別接種在調(diào)好pH 的平板上，每個(gè)處理3 次重復(fù)。接種后，把平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，接種后5 d 用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑并記錄。

1.2.7 7 種殺菌劑對(duì)N.sphaerica（S2-1）的抑制率測(cè)定 通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法［15］，在PDA培養(yǎng)基中分別加入濃度為5、15、25、35、45、55 mg/L 的苯醚甲環(huán)唑,0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L 的50%丙環(huán)唑,0.18、0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/L 的苯甲·福美雙,0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L 的咪鮮胺,0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.4 mg/L的施保功,2.5、5、10、15、20、25、35 mg/L的噻唑鋅,2.5、5、10、15、20、25 mg/L 的噁菌靈制成含藥培養(yǎng)基；然后在培養(yǎng)7 d 的N.sphaerica菌落上用滅菌打孔器取直徑為5 mm 菌餅，將菌餅生長(zhǎng)菌絲的一面朝下接種在各含藥培養(yǎng)基和空白PDA 培養(yǎng)基平板中央（每個(gè)平板接種1 個(gè)菌餅），每個(gè)處理3 次重復(fù)，并放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)；然后在培養(yǎng)3、4、5、6 d 采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑并記錄，每個(gè)處理4 次重復(fù)，計(jì)算不同處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率：

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行處理，采用DPS2005 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗黑孢霉葉斑病及其病原菌特征

從發(fā)病的黑皮甘蔗葉片和葉鞘上分離獲得6株分離菌株，其中1 株與其他分離株的菌落形態(tài)均不一樣；我們把這株不一樣的分離菌株命名為S1，其他分離菌株編號(hào)為S2-1～S2-5，其中S2-1～S2-5 在菌落形態(tài)和培養(yǎng)特性方面均一致。S1在PDA 上培養(yǎng)7 d 后的菌落形態(tài)為圓形，中心淡紫色，其他部位為白色；在顯微鏡下觀察，其有大、小2 種孢子，大孢子為明顯的鐮刀狀，小孢子為卵圓形（圖1A、D）。S2-1～S2-5 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d 后，菌落圓形，顏色從中央依次為黑色、黃色和白色（圖1B）；培養(yǎng)7 d 后，隨著色素的積累，整個(gè)菌落呈現(xiàn)黑色（圖1C）。本試驗(yàn)選取S2-1 為代表菌株，S2-1 的菌絲有分隔和分叉，白色和黑色；分生孢子單生、頂生，單孢球形或近球形，黑色，表面光滑，直徑10.2～15.8 μm（圖1E）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀，初步判斷S1 為鐮刀菌屬真菌，S2-1～S2-5 為球黑孢病菌Nigrospora sphaerica（Sacc.）Mason［16］。

圖1 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的分離及分子鑒定Fig.1 Isolation and molecular identification of the pathogen of sugarcane Nigrospora blight

2.2 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的致病性測(cè)定和分子生物學(xué)鑒定

為進(jìn)一步明確甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌，分別對(duì)S1 和S2-1 在甘蔗上進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果（圖2）表明，S1 在甘蔗上不具有致病性，S2-1 能夠在甘蔗上引起與田間相似的病害癥狀。同時(shí)，以帶菌的甘蔗莖稈和健康甘蔗莖稈為種子種植在滅菌土壤中，放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)和田間，均進(jìn)行正常的肥水管理；1 個(gè)月后，以帶菌甘蔗莖稈為種子長(zhǎng)出的甘蔗苗葉片從葉尖到葉基表現(xiàn)出明顯的白條癥狀；在田間的試驗(yàn)中也表現(xiàn)出相同的癥狀。而以健康甘蔗莖稈為種子長(zhǎng)出的甘蔗苗則沒(méi)有表現(xiàn)出任何癥狀。再次對(duì)這些發(fā)病甘蔗苗進(jìn)行病原菌分離仍然能夠獲得與S2-1 菌落形態(tài)和生物學(xué)特性相一致的病原菌。以上結(jié)果表明，甘蔗黑孢霉葉斑病為甘蔗的種傳病害。

圖2 菌株S2-1 在甘蔗上的致病性測(cè)定Fig.2 Pathogenicity determination of strain S2-1 on sugarcane

利用真菌ITS 序列通用引物對(duì)菌株S2-1 的DNA 擴(kuò)增，獲得大小約為580 bp 的片段。將該ITS 序列進(jìn)行測(cè)序，并將序列提交至NCBI，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S2-1 的ITS（登錄號(hào)：MW832509）與來(lái)自N.sphaericaPTA1 的ITS（登錄號(hào)：KM893076.1）在序列的相似性和覆蓋性上均為100%。同時(shí)通過(guò)MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大似然法建立菌株S2-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，S2-1 與黑孢霉菌株P(guān)TA1 在一個(gè)分支上，而與N.oryzaeBY-D（KF924041）和N.osmanthiCOL2（MH645207）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)菌株S2-1的形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌鑒定為球孢霉菌N.sphaerica（圖3）。

圖3 基于ITS 序列以最大似然法構(gòu)建菌株S2-1 與Nigrospora sp.其他種的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain S2-1 and Nigrospora sp. based on ITS sequence with maximum likelihood method

2.3 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的檢測(cè)

通過(guò)PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，Ng1F/ Ng1R 能夠?qū)в懈收岷阪呙谷~斑病的甘蔗病樣及其病原菌N.sphaerica進(jìn)行有效擴(kuò)增（圖4A），而Ng2F/ Ng2R 則不能夠?qū)σ陨细收岵舆M(jìn)行有效擴(kuò)增。因此Ng1F/ Ng1R 可以作為檢測(cè)甘蔗黑孢霉葉斑病的檢測(cè)引物。

2.4 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)S2-1 菌絲生長(zhǎng)的影響 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌S2-1 對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，在10～30 ℃范圍內(nèi)，S2-1 均能生長(zhǎng)。但當(dāng)溫度為5 ℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)；而當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率明顯下降。最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，其次為20 ℃（圖4B）。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)速率最快；培養(yǎng)4 d 后，菌落直徑已經(jīng)達(dá)到80 mm，且與20 ℃和30 ℃之間的差異明顯（圖4B）。

2.4.2 pH 對(duì)S2-1 菌絲生長(zhǎng)的影響 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌S2-1 對(duì)酸堿度適應(yīng)范圍較廣，在pH 為4～8 范圍內(nèi)均可以正常生長(zhǎng)。但以pH7 時(shí)菌落生長(zhǎng)速率最快，培養(yǎng)4 d 后平均菌落直徑為80 mm；隨著pH 升高，菌絲生長(zhǎng)速度開(kāi)始下降。當(dāng)pH 為9 時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)（圖4C）。

圖4 Nigrospora sphaerica 的檢測(cè)電泳及其在不同溫度和pH 條件下的菌落生長(zhǎng)直徑Fig.4 Detection electrophoresis of Nigrospora sphaerica and its colony growth diameter on PDA plate under different temperatures and pH

2.5 甘蔗黑孢霉葉斑病菌室內(nèi)最佳防治藥劑篩選

咪鮮胺對(duì)甘蔗黑孢霉葉斑病菌的抑菌效果最好，最高可達(dá)到98%；苯醚甲環(huán)唑和施保功的抑菌效果次之，最高可達(dá)到90%和93%；50%丙環(huán)唑、苯甲·福美雙和噁菌靈的防治效果較差，最高在70%～81%之間；而噻唑鋅則完全沒(méi)有抑菌效果（圖5 和表1）。因此，在對(duì)甘蔗黑孢霉葉斑病進(jìn)行防治時(shí)可優(yōu)先選用咪鮮胺，也可選用苯醚甲環(huán)唑和施保功進(jìn)行交叉使用。

表1 共培養(yǎng)6 d 后7 種殺菌劑對(duì)Nigrospora sphaerica 在PDA 平板上菌落生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 After co-cultivate 6days,indoor inhibition effect of 7 fungicides on the growth of conloy of Nigrospora sphaerica on PDA

圖5 7 種殺菌劑對(duì)Nigrospora sphaerica 在PDA 平板上生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of 7 fungicides on the growth of Nigrospora sphaerica on PDA plates

為了選出不同殺菌劑在室內(nèi)抑制甘蔗黑孢霉葉斑病菌生長(zhǎng)效果最佳的使用濃度，通過(guò)對(duì)以上供試藥劑梯度濃度（具體濃度見(jiàn)1.2.7）進(jìn)行抑菌測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：咪鮮胺的抑菌濃度最低，抑菌效果最好，在0.16 mg/L 時(shí)抑菌效果達(dá)到98%；其次是施保功，在2.4 mg/L 時(shí)抑菌效果達(dá)到93%，而苯醚甲環(huán)唑在濃度為35 mg/L 時(shí)抑菌濃度最高為90%，其他藥劑的防治效果均不理想。因此在防治甘蔗黑孢霉葉斑病時(shí)推薦使用0.16 mg/L 咪鮮胺藥劑和2.4 mg/L 施保功藥劑。

3 討論

種苗安全對(duì)甘蔗的安全生產(chǎn)有著極其重要的作用。本研究中，甘蔗黑孢霉葉斑病為甘蔗上新發(fā)現(xiàn)的種傳病害，由黑孢霉N.sphaerica引起；該病害為本課題組2016 年和2017 年在廣東省廣州市南沙區(qū)田間的黑皮果蔗上發(fā)現(xiàn)［17］。甘蔗黑孢霉葉斑病在甘蔗成株期發(fā)病時(shí)，主要影響甘蔗糖分的積累；但是在甘蔗幼苗期發(fā)病時(shí)會(huì)造成甘蔗植株的整株枯死，而且一旦種莖帶病，長(zhǎng)出的苗子則100%帶病。甘蔗黑孢霉葉斑病嚴(yán)重影響甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量。

近年來(lái)越來(lái)越多關(guān)于N.sphaerica引起病害的報(bào)道，如在印度的茶葉、中國(guó)的茶花和青錢(qián)柳上引起黑孢霉葉斑病等［16,18-20］。但關(guān)于N.sphaerica引起甘蔗黑孢霉葉斑病及其病原菌的生物學(xué)特性還是首次報(bào)道。過(guò)去甘蔗病害的防治主要以培育抗病品種為主，輔助以化學(xué)藥劑防治和栽培管理（如種植密度、種植方式及肥水管理等）［21-22］；但對(duì)于種傳甘蔗病害則首先是加強(qiáng)引種檢疫，并多采用與其他作物進(jìn)行輪作、種植無(wú)病種苗及改變施肥模式等［2,23-24］。甘蔗作為用蔗莖腋芽進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物，由于多年反復(fù)種植，極易受到種苗傳播病原的反復(fù)侵染，而且一旦侵染，將會(huì)給甘蔗產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大損失。研究者們?cè)诿摱窘】捣N苗的生產(chǎn)方面采用了各種方法，如熱蒸汽消毒種苗、熱水浸種消毒以及后來(lái)的熱水浸種消毒結(jié)合組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)；同時(shí)通過(guò)建立三級(jí)苗圃制來(lái)進(jìn)一步杜絕危險(xiǎn)性病害的蔓延，保證種苗的健康［25-26］。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，N.sphaerica的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適pH 為7，因此也可通過(guò)以上方法對(duì)種苗進(jìn)行脫毒處理。此外，也有研究表明甘蔗間套種綠豆可通過(guò)改善土壤環(huán)境提高甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)［27-29］；同時(shí)通過(guò)7 種不同殺菌劑對(duì)N.sphaerica的抑菌性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺和施保功可用以對(duì)甘蔗蔗種進(jìn)行浸種處理或在甘蔗下種前，與細(xì)土混合后撒施在甘蔗基部。而在過(guò)去也有報(bào)道咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑在甘蔗病害的防控上發(fā)揮重要作用，如咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)Ω收岷謼l病有明顯的防治效果，但苯醚甲環(huán)唑?qū)Ω收岷阪呙谷~斑病病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定效果則欠佳［30］。

4 結(jié)論

引起種傳病害甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌為N.sphaerica，引物Ng1F/ Ng1R 可以作為田間和室內(nèi)對(duì)甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的檢測(cè)；通過(guò)對(duì)N.sphaerica的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適生長(zhǎng)pH 為7；咪鮮胺藥劑0.16 mg/L 和施保功藥劑2.4 mg/L 對(duì)N.sphaerica的抑菌效果最顯著，抑菌效果均可達(dá)到93%以上，推薦這2 種藥劑作為甘蔗蔗種處理和田間施用藥劑?；瘜W(xué)藥劑防治僅是防治甘蔗黑孢霉葉斑病發(fā)生的一個(gè)措施，最有利的防治手段還是加強(qiáng)甘蔗的種苗檢測(cè)，尤其是在引種時(shí)和蔗區(qū)調(diào)種時(shí)。