干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗光合作用與葉片組織結(jié)構(gòu)的影響

曾維軍，屈坤杰，萬(wàn) 誠(chéng)，李 鵬，席培宇，李蕾佳，王濟(jì)紅

（1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009；2.上海市巖土地質(zhì)研究院有限公司，上海 200072）

【研究意義】毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl.var.lanuginosa）是樟科木姜子屬植物朝鮮木姜子（L.coreana）的變種，零星分布于貴州、四川、重慶、安徽、廣東和云南等亞熱帶地區(qū)。嫩葉是西南地區(qū)傳統(tǒng)茶飲老鷹茶的主要原料，具有消暑解渴、消食祛脹、降血糖血脂等功效［1-2］。在實(shí)際應(yīng)用中，作為老鷹茶原料的毛豹皮樟種植于坡地，洪澇較少，但地理、氣候等環(huán)境因素造成的干旱缺水情況較多，制約毛豹皮樟的生長(zhǎng)發(fā)育，間接影響老鷹茶的品質(zhì)，所以在干旱脅迫下對(duì)毛豹皮樟進(jìn)行植物逆境生理研究尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近5 年，關(guān)于毛豹皮樟的研究主要集中在形態(tài)特征及地理分布［3］、遺傳選育［4］、開(kāi)發(fā)及利用［5］、化學(xué)成分及藥理作用、生理特征、分子生物學(xué)等方面。例如，唐茜等［6-7］研究表明，礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)主要是鉀、鎂、磷、鈣、鈉、鐵和錳，均為人體必需營(yíng)養(yǎng)，其中鉀參與人體蛋白質(zhì)、氨基酸和碳水化合物的代謝，對(duì)心臟和心血管具有保護(hù)作用，能降低血壓［8］。范川等研究了毛豹皮樟苗木對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)毛豹皮樟的過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量在處理溫度及品種間具有顯著差異，均可作為毛豹皮樟抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（SOD）與毛豹皮樟抗?jié)承杂袠O強(qiáng)的相關(guān)性［5］；經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，毛豹皮樟的CAT、POD 活性及SS、MDA 含量在處理溫度及品種間都有顯著差異，均可作為毛豹皮樟抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)［9-10］。鞏艷紅等［11］采用改良SDS 法從毛豹皮樟的老、幼葉片中提取到高質(zhì)量DNA，可以用于RAPD 分析，從4組隨機(jī)引物中篩選出16 個(gè)顯示毛豹皮樟遺傳差異的多態(tài)性引物，該方法適用于毛豹皮樟的種質(zhì)資源鑒定分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于逆境生理下葉片光合能力及組織形態(tài)差異的相關(guān)研究少見(jiàn)報(bào)道，不能進(jìn)一步闡明毛豹皮樟生理生態(tài)的相關(guān)規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以用于生產(chǎn)種植的毛豹皮樟扦插苗為研究對(duì)象，探究不同程度干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片組織結(jié)構(gòu)及光合作用的影響，探究毛豹皮樟扦插苗逆境生理特性，為其高效栽培管理技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為毛豹皮樟3年生扦插苗，平均株高25（±2）cm、基徑粗3（±0.5）mm，由貴州省生物研究所培育。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于貴州省湄潭縣興隆鎮(zhèn)丁家溝村（107°48′E、27°67′N(xiāo)）。試驗(yàn)場(chǎng)地為覆膜簡(jiǎn)易大棚，用透光率50%的遮陽(yáng)網(wǎng)做外遮陽(yáng)，溫度為自然變溫，簡(jiǎn)易塑料大棚上覆蓋透光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)。試驗(yàn)地屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，夏季溫暖濕潤(rùn)，冬季干燥寒冷，年均氣溫14.9℃，最冷月（1 月）平均氣溫3.8℃，最熱月（7 月）平均氣溫25.1℃，無(wú)霜期平均284 d，年日照時(shí)數(shù) 1 163 d。試驗(yàn)于2018 年6 月進(jìn)行，該月平均氣溫25.6℃。

1.3 試驗(yàn)方法

用口徑15 cm×高20 cm 塑料盆栽植，栽培基質(zhì)為腐質(zhì)土、蛭石（體積比1 ∶1）的混合基質(zhì)；每盆裝入基質(zhì)1.0 kg，定植1 株。確定混合基質(zhì)田間最大持水量，設(shè)置4 種不同程度的干旱脅迫處理：CK（土壤體積持水量為39.6%）、輕度（土壤體積持水量為29.2%）、中度（土壤體積持水量為19.5%）、重度（土壤體積持水量為9.7%），采取稱(chēng)重法定期補(bǔ)水。每個(gè)處理30 株苗，3 次重復(fù)。2018年1月2日定植，2月1日開(kāi)始處理（定植30 d），5 月5 日后所有處理統(tǒng)一水管理（5 d 澆一次透水），6 月5～10 日開(kāi)始取樣和測(cè)量相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 光合日變化測(cè)定 6 月5 日，晴天，8：00～ 18：00，每隔1 h 分別選定相同干旱處理下3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝的一片成熟葉，使用Li6400光合測(cè)定儀（LI-COR，美國(guó)）測(cè)量其凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr），同時(shí)記錄光合有效輻射（PAR）、空氣中CO2濃度（Ca）、空氣溫度（T）及相對(duì)濕度（RH）。

1.4.2 光合氣體交換參數(shù)測(cè)定 6 月10 日，晴天，9：30～11：30，使用帶紅藍(lán)光源的LI6400 光合測(cè)定儀（LI-COR，美國(guó)），以對(duì)照頂枝葉片光響應(yīng)曲線(xiàn)光飽和點(diǎn)（1 192 μmol/m2·s）為參考，設(shè)定光強(qiáng)1 100 μmol/m2·s，選定相同干旱處理下3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝的一片成熟葉，測(cè)量其Pn、Gs、Ci、Tr。

1.4.3 葉片氣孔限制值水分利用效率、計(jì)算 氣孔限制值Ls=1-Ci/Ca。其中，Ca 為空氣中CO2濃度。水分利用效率WUE=Pn/Tr。

1.4.4 葉綠素總量測(cè)定 不同干旱脅迫程度下各選取3 株毛豹皮樟扦插苗頂枝一片成熟葉，使用UV-1800SPC 雙光束紫外分光光度計(jì)（Macy，中國(guó)美析儀器有限公司），采用丙酮乙醇混合液法測(cè)定葉綠素總量（Tc）［12］。

1.4.5 葉片組織結(jié)構(gòu)測(cè)量 不同干旱脅迫程度下各選取1 株毛豹皮樟扦插苗頂枝一片成熟葉進(jìn)行制片，使用Primovert 顯微鏡（ZEISS，德國(guó)卡爾·蔡司股份公司）在每張切片上隨機(jī)挑選5 個(gè)200 倍視野進(jìn)行觀察和拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件以200 倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，選取10 處測(cè)量每張片子上表皮厚度、下表皮厚度，測(cè)量柵欄組織和海綿組織的厚度、密度（每個(gè)視野中柵欄組織和海綿組織的個(gè)數(shù)）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Graph Pad Prism9.0，對(duì)不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數(shù)、水分利用效率、氣孔限制值、葉綠素總量進(jìn)行方差分析，采用S-N-K 法進(jìn)行多重比較，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)可視化。使用SPSS24.0 軟件，采用皮爾遜相關(guān)性分析法對(duì)光合和環(huán)境日變化參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化的影響

由表1可知，輕度干旱脅迫下毛豹皮樟扦插苗葉片沒(méi)有明顯的光合午休現(xiàn)象，曲線(xiàn)呈單峰型，日均凈光合速率為3.53 μmol/m2·s，15：00 時(shí)凈光合速率達(dá)峰值6.22 μmol/m2·s；CK、中度、重度干旱脅迫的日均凈光合速率分別為3.69、3.33、1.97 μmol/m2·s，均存在明顯光合午休現(xiàn)象，其中CK曲線(xiàn)呈單峰型，光合午休時(shí)間最短、為1 h；中度、重度干旱脅迫的光合日變化為雙峰曲線(xiàn)；重度干旱下凈光合速率日變異系數(shù)最大、為68.23%，CK最小、為28.65%。

表1 不同干旱脅迫程度下豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化Table 1 Diurnal changes of net photosynthetic rate of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings under different drought stresses

2.2 不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數(shù)日變化相關(guān)性分析

如表2 所示，在毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數(shù)的16 組對(duì)應(yīng)組合中，CK 有10 組對(duì)應(yīng)組合顯著相關(guān)，輕度干旱脅迫有15 組，中度干旱脅迫15 組，重度干旱脅迫11 組；CK 的Ci 與RH 的正相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為0.689，Tr 與RH 的負(fù)相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為-0.593；輕度干旱脅迫下，Ci 與RH 的正相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為0.870，Pn 與Ca 的負(fù)相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為-0.920；中度干旱脅迫下，Gs 與RH 的正相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為0.749，Gs 與T 的負(fù)相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為-0.723；重度干旱脅迫下，Gs與RH 的正相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為0.913，Gs與T 的負(fù)相關(guān)性最高、相關(guān)系數(shù)為-0.869。

表2 不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片光合和環(huán)境參數(shù)日變化相關(guān)性Table 2 Correlation of diurnal changes of leaf photosynthetic and environmental parameters of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings under different drought stresses

2.3 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數(shù)的影響

如圖1 所示，隨著干旱脅迫程度增加，毛豹皮樟扦插苗葉片Pn 均值顯著降低，數(shù)據(jù)離散程度增加，中度干旱脅迫的Pn 均為接近于0 的負(fù)值；CK 的Gs 顯著高于其他3 個(gè)干旱處理，中度、重度干旱脅迫下的Gs 差異不顯著；兩者Ci 均值較高，CK 的Ci 均值較低，CK、重度干旱脅迫的Ci值聚集程度較高；處理間Tr 相比較，CK 與輕度干旱脅迫差異不顯著，但顯著高于中度、重度干旱脅迫。

圖1 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片氣體交換參數(shù)的影響Fig.1 Effects of drought stresses on gas exchange parameters of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

2.4 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片水分利用效率、氣孔限制值和葉綠素總量的影響

由圖2 所示，中度、重度干旱脅迫下毛豹皮樟扦插苗葉片的Ls、WUE 均為負(fù)值，其中重度干旱脅迫下的Ls 值最低，中度干旱脅迫下的WUE 值最低，輕度干旱脅迫下的Ls 顯著高于CK，CK 的WUE 顯著高于輕度干旱脅迫，是輕度干旱脅迫下的近兩倍。CK 的Tc 為1.61 mg/L，極顯著高于輕度、重度干旱脅迫，顯著高于中度干旱脅迫，其中輕度和重度干旱脅迫下的WUE 差異不顯著，但均顯著低于中度干旱脅迫。

圖2 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片水分利用效率、氣孔限制值和葉綠素總量的影響Fig.2 Effect of drought stresses on WUE,Ls and Tc of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

2.5 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖3、圖4 可知，3 個(gè)干旱處理的毛豹皮樟扦插苗葉片上表皮厚度均顯著小于CK；隨著干旱脅迫程度增加，葉片下表皮厚度先減后增；CK 的柵欄組織厚度最高、輕度最低；海綿組織厚度均值的變化隨干旱脅迫的加強(qiáng)而先增后減，重度干旱脅迫的海綿組織厚度均值最高、為0.097 mm；干旱處理下的葉片柵欄組織密度與CK 相比均不顯著；輕度干旱脅迫的葉片海綿組織密度為179 個(gè)，顯著高于CK。

圖3 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of drought stresses on the microstructure of leaf transverse tissue structures of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa

圖4 干旱脅迫對(duì)毛豹皮樟扦插苗葉片橫切組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of drought stresses on leaf transverse tissue structure of Litsea coreana Levl.var.lanuginosa cutting seedlings

3 討論

“光合午睡”過(guò)長(zhǎng)不利于植物光合作用積累有機(jī)物。對(duì)照、中度、重度干旱脅迫下毛豹皮樟均有明顯“光合午睡”現(xiàn)象，中度時(shí)間最長(zhǎng)，輕度干旱脅迫無(wú)此現(xiàn)象，說(shuō)明輕度干旱脅迫能打破毛豹皮樟“光合午睡”，但繼續(xù)干旱脅迫會(huì)加重該現(xiàn)象，不利于光合作用。光合能力是植物進(jìn)行新陳代謝的基礎(chǔ)，也是影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量的重要條件［13］。凈光合速率反映植物積累有機(jī)物快慢，是衡量光合能力的重要參數(shù)。凈光合速率日變化模式有雙峰型、單峰型、平坦型和不規(guī)則型等多種類(lèi)型［14］，不同干旱脅迫程度下毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率日變化類(lèi)型主要是雙峰型和單峰型。重度干旱脅迫下的凈光合速率日變異系數(shù)最大，高于對(duì)照2 倍，同時(shí)均值和最大值也最低，說(shuō)明自然環(huán)境中遇到嚴(yán)重干旱，毛豹皮樟利用光能合成有機(jī)物的水平較低且不穩(wěn)定。隨著干旱程度增加，光合參數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性先增后降，且相關(guān)程度也在發(fā)生變化，其中關(guān)聯(lián)性較高的環(huán)境因子為空氣相對(duì)濕度和溫度。

干旱脅迫往往顯著降低植物的光合作用［15］，與本試驗(yàn)中“毛豹皮樟扦插苗葉片凈光合速率均值伴隨干旱脅迫程度增加而顯著降低”的結(jié)論相似。對(duì)照的氣孔導(dǎo)度高，胞間CO2濃度低，干旱脅迫下則相反，說(shuō)明干旱脅迫顯著影響毛豹皮樟扦插苗葉片的氣孔開(kāi)張程度，讓氣孔變小甚至關(guān)閉，導(dǎo)致胞間CO2濃度升高。中度和重度干旱下，氣孔限制值和水分利用效率呈負(fù)值，說(shuō)明中度干旱開(kāi)始毛豹皮樟扦插苗已經(jīng)缺水、葉片氣孔不能正常工作，同時(shí)影響葉片葉綠素合成、葉綠素總量降低，但在中度干旱下，葉綠素總量有小幅增加，可能是毛豹皮樟響應(yīng)干旱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。

在自然生長(zhǎng)條件下，核酮糖-1,5-二磷酸梭化酶／加氧酶（Rubisco）的活化、核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）的再生是完整葉片以最佳狀態(tài)進(jìn)行光合作用的兩個(gè)重要代謝步驟，主要發(fā)生在葉片的柵欄組織和海綿組織細(xì)胞內(nèi)［16-17］。細(xì)胞內(nèi)真正的CO2供應(yīng)速率，則受葉片表皮部分氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的控制［18-20］。3 個(gè)干旱處理的葉片上表皮厚度均顯著小于對(duì)照，說(shuō)明干旱脅迫通過(guò)改變表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的狀態(tài)來(lái)影響CO2供應(yīng)速率，從而影響毛豹皮樟扦插苗的光合速率；CK 葉片柵欄組織厚度最高，重度干旱脅迫最低，中度干旱脅迫的葉片海綿組織厚度均值最高，輕度干旱脅迫的葉片海綿組織密度最高與中度、重度干旱脅迫差異不顯著，說(shuō)明毛豹皮樟扦插苗葉片在干旱脅迫下響應(yīng)光合作用而特化出來(lái)的細(xì)胞減少、氣體交換增加，柵欄組織是豹皮樟扦插苗葉片傳遞環(huán)境改變信號(hào)的傳遞層，而海綿組織則是應(yīng)對(duì)這種環(huán)境改變的反應(yīng)層。

4 結(jié)論

干旱脅迫影響毛豹皮樟扦插苗葉片“光合午睡”時(shí)長(zhǎng)、凈光合速率日變化及氣體交換參數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性，重度干旱加重“光合午睡”，降低光合能力，維持葉片正常光合生理需增加空氣水分、降低溫度；干旱脅迫影響毛豹皮樟扦插苗葉片氣孔開(kāi)張狀態(tài)和葉綠素總量，中度干旱下能增加葉片葉綠素總量來(lái)響應(yīng)干旱脅迫，重度干旱嚴(yán)重影響其水分利用和氣體交換；毛豹皮樟扦插苗通過(guò)降低葉片上表皮厚度、增加?xùn)艡诮M織厚度、降低海綿組織厚度來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。