缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其對(duì)中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值

徐 麗，毛居旦·阿不力孜，楊 麗

缺血性腦卒中是一種因腦組織供血障礙引起腦組織壞死從而導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的臨床綜合征，約占所有卒中的70%，近年其發(fā)病率逐年升高，給社會(huì)及家庭帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1]。有研究顯示，缺血性腦卒中的發(fā)病因素較多，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄是其發(fā)病重要病理生理基礎(chǔ)[2]。顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄通常由動(dòng)脈粥樣硬化引起，隨著動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄發(fā)生概率逐漸升高，患者發(fā)生缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)也隨之加大[3]。因此，臨床上對(duì)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的評(píng)估顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)作為一種基因調(diào)控分子，在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有望作為缺血性腦卒中診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志物[4]。然而，目前有關(guān)血清miRNA水平與缺血性腦卒中患者顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度關(guān)系方面的研究及血清miRNA水平檢測(cè)對(duì)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄診斷價(jià)值方面的研究較少。本研究探討缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p、miR-27b-3p水平及其對(duì)中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值，旨在為缺血性腦卒中的早期診斷及防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月—2020年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的缺血性腦卒中136例的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且均經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診；②性別不限，年齡≥18歲；③首次發(fā)病，發(fā)病至入院時(shí)間≤72 h，且入院前未接受過(guò)溶栓治療；④臨床資料完整；⑤患者和(或)其家屬簽署相關(guān)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因非動(dòng)脈粥樣硬化因素導(dǎo)致的缺血性腦卒中患者；②有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史患者；③合并重要臟器功能障礙和惡性腫瘤患者；④合并血液系統(tǒng)或自身免疫系統(tǒng)疾病患者。本研究符合“赫爾辛基宣言”，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意執(zhí)行。

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集：收集入選患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)疾病(高血壓病、糖尿病和心房顫動(dòng))、發(fā)病至入院時(shí)間、入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分、吸煙史和飲酒史。吸煙史：每天吸煙≥1次，持續(xù)時(shí)間≥2年；飲酒史：平均每日飲酒量≥50 g，持續(xù)時(shí)間≥1年。

1.2.2一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)：入選患者一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)均于入院后24 h內(nèi)完成。采集入選患者晨起肘靜脈血5 ml，2500 r/min離心5 min，分離血清后，低溫保存待測(cè)。采用全自動(dòng)生化分析儀(7020型，日本日立有限公司生產(chǎn))檢測(cè)入選患者一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括尿酸、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平檢測(cè)：采集入選患者晨起肘靜脈血5 ml，2500 r/min離心5 min，分離血清后，低溫保存待測(cè)。應(yīng)用miRNeasy Mini Kit試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn))提取血清總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(DU800型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司生產(chǎn))測(cè)定RNA濃度及純度，檢測(cè)波長(zhǎng)為260或280 nm，以稀釋RNA的無(wú)酶水為空白對(duì)照，吸光度值為1.8～2.1表明RNA質(zhì)量合格?？俁NA經(jīng)凝膠電泳分離、純化，后逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)，逆轉(zhuǎn)錄條件為16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、10 min，獲得cDNA后于-20℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(天根生化科技有限公司生產(chǎn))，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，反應(yīng)體系：2×miRcute miRNA Premix 10 μl、0.4 μl正向引物(10 μmol/L)、0.4 μl反向引物(10 μmol/L)、2 μl miRNA第1鏈cDNA、1.6 μl ROX參比染料(50×)、5.6 μl雙蒸水，總反應(yīng)體系20 μl；循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性2 min為1個(gè)循環(huán);94℃ 20 s、60℃ 34 s，共計(jì)43個(gè)循環(huán)。miRNA表達(dá)結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算[6]，每個(gè)樣本檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.4數(shù)字減影血管造影(DSA)檢查：應(yīng)用DSA機(jī)(Artic Zee Ceiling，德國(guó)西門(mén)子股份有限公司生產(chǎn))對(duì)入選患者顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄情況進(jìn)行檢查，采用改良Seldinger技術(shù)穿刺患者一側(cè)股動(dòng)脈，插入5F動(dòng)脈鞘行主動(dòng)脈弓造影，Hunter導(dǎo)管分別置于雙側(cè)頸總動(dòng)脈、椎動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，注入造影劑(碘海醇)后造影。造影劑注入速度為5～20 ml/s，總量為5～30 ml，壓力為200～700 Pa。

1.2.5顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄情況評(píng)估：由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的影像科醫(yī)師對(duì)DSA圖像進(jìn)行雙盲分析，對(duì)不確定的影像資料，采取協(xié)商方式統(tǒng)一意見(jiàn)。血管狹窄率=(正常血管直徑-狹窄部位最小直徑)/正常血管直徑×100%，以血管狹窄率<30%為輕度狹窄，血管狹窄率30%～70%為中度狹窄，血管狹窄率≥70%為重度狹窄[5]。根據(jù)顱內(nèi)外動(dòng)脈是否狹窄將入選的缺血性腦卒中136例分為狹窄組和對(duì)照組兩組，根據(jù)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度將狹窄組分為輕度狹窄組、中度狹窄組和重度狹窄組3個(gè)亞組。

2 結(jié)果

2.1狹窄組和對(duì)照組臨床資料比較 缺血性腦卒中136例經(jīng)DSA檢查共檢出顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄95例(狹窄組)，無(wú)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄41例(對(duì)照組)。狹窄組血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組性別、年齡、BMI、基礎(chǔ)疾病、發(fā)病至入院時(shí)間、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、吸煙史、飲酒史和血清TG、HDL-C水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2不同顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度缺血性腦卒中3組臨床資料比較 顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄95例中，共檢出輕度狹窄28例(輕度狹窄組)，中度狹窄31例(中度狹窄組)，重度狹窄36例(重度狹窄組)。不同顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度缺血性腦卒中3組血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；性別、年齡、BMI、基礎(chǔ)疾病、發(fā)病至入院時(shí)間、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、吸煙史、飲酒史和血清TG、HDL-C水平總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血清尿酸、TC、LDL-C、miR-17-5p和miR-27b-3p水平輕度狹窄組和中度狹窄組低于重度狹窄組，輕度狹窄組低于中度狹窄組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 不同顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度缺血性腦卒中3組臨床資料比較

2.3血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制ROC曲線分析血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)分別為0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者聯(lián)合檢測(cè)明顯高于單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表3。

圖1 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值的受試者工作特征曲線

表3 血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值的受試者工作特征曲線分析結(jié)果

3 討論

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，20%～48%的缺血性腦卒中由顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄引起，且多數(shù)復(fù)發(fā)性病例也發(fā)生于相同的動(dòng)脈狹窄供血區(qū)域[7-8]。患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化后，斑塊內(nèi)新生血管破裂后形成血栓，使動(dòng)脈狹窄或完全阻塞，導(dǎo)致腦部供血中斷，引發(fā)缺血性腦卒中；此外，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄造成慢性腦灌注不足也增加了缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度對(duì)缺血性腦卒中臨床治療具有重要意義。

miRNA廣泛參與機(jī)體基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過(guò)程，在免疫損傷、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究顯示，miR-17-5p表達(dá)異常與心肌梗死后血管形成有關(guān)[11]；miR-27b-3p在肥胖人群中呈高表達(dá)，在棕色脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，是治療肥胖和胰島素抵抗的潛在靶點(diǎn)[12]。本研究分析缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平，結(jié)果顯示狹窄組miR-17-5p和miR-27b-3p水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平較高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p可能為評(píng)估顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Tan等[13]以動(dòng)脈粥樣硬化小鼠為研究對(duì)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清miR-17-5p水平明顯升高，極低密度脂蛋白受體(VLDLR)水平有所下降；且拮抗miR-17-5p后，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠VLDLR下降情況有所恢復(fù)，推測(cè)VLDLR是miR-17-5p的直接靶點(diǎn)，miR-17-5p抑制劑可通過(guò)上調(diào)血清VLDLR水平，緩解動(dòng)脈粥樣硬化病理改變情況。極低密度脂蛋白(VLDL)由TC、TG和膽固醇酯等組成，以TG占比最高，當(dāng)VLDL水平升高時(shí)，TC和TG水平也明顯升高，導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生率升高[14]。本研究結(jié)果顯示狹窄組TC水平高于對(duì)照組，也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。miR-27b-3p是血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控miRNA，其表達(dá)水平升高可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[15]。Cheng等[16]研究急性缺血性腦卒中診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)與健康者相比，急性缺血性腦卒中患者血清miR-27b-3p水平顯著升高，認(rèn)為血清miR-27b-3p是診斷缺血性腦卒中的良好血源性生物標(biāo)志物。

本研究進(jìn)一步分析不同顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平發(fā)現(xiàn)，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平輕度狹窄組和中度狹窄組低于重度狹窄組，輕度狹窄組低于中度狹窄組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平與缺血性腦卒中患者顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄密切相關(guān)，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度越高，二者表達(dá)水平越高。分析其原因：①缺血性腦卒中發(fā)生后，缺血半暗帶內(nèi)細(xì)胞在氧化應(yīng)激作用下會(huì)產(chǎn)生大量自由基，抑制新生血管形成，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制，而miR-17-5p在氧化應(yīng)激中表達(dá)上調(diào)[17]；②胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)水平升高與缺血性腦卒中病情有密切關(guān)系，IGF-1可刺激血管平滑肌增殖及遷移，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，使患者發(fā)生顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄，而miR-27b-3p高表達(dá)會(huì)影響IGF-1結(jié)合蛋白對(duì)IGF-1的調(diào)控，增加患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，使動(dòng)脈狹窄程度加重[18]。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值的AUC血清miR-17-5p和miR-27b-3p及二者聯(lián)合檢測(cè)分別為0.677、0.688和0.804，血清miR-17-5p和miR-27b-3p二者聯(lián)合檢測(cè)明顯高于單獨(dú)檢測(cè)。提示血清miR-17-5p和miR-27b-3p可作為預(yù)測(cè)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的良好指標(biāo)。因此，臨床可根據(jù)缺血性腦卒中患者血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平評(píng)估顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄情況，以及時(shí)采取相應(yīng)干預(yù)措施，改善患者預(yù)后。

總之，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平與缺血性腦卒中患者顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄密切相關(guān)，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度越高，血清miR-17-5p和miR-27b-3p水平越高。血清miR-17-5p和miR-27b-3p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)缺血性腦卒中患者中重度顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄預(yù)測(cè)價(jià)值高于血清miR-17-5p和miR-27b-3p單獨(dú)檢測(cè)。