5種生物農(nóng)藥對蘆筍莖枯病的防治效果

楊 帥 徐淑兵 金 巖 張國福 馮永新 王紅艷*

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2 山東省農(nóng)藥檢定所，山東濟(jì)南 250100；3 河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊 050051）

蘆筍（Asparagus officinalis）又稱石刁柏，為百合科天門冬屬，是世界十大名菜之一，在國際市場上被稱為“蔬菜之王”，我國是世界第一大蘆筍生產(chǎn)國和出口國（魯博，2018）。蘆筍莖枯病由天門冬擬莖點(diǎn)霉菌〔Phomopsis asparagi（Sacc.）Bubak〕引起（劉克均 等，1991），是蘆筍上發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一，在全世界均有發(fā)生（陳光宇，2013）。隨著蘆筍連作和種植面積的擴(kuò)大，莖枯病的危害越來越嚴(yán)重，影響了我國蘆筍的出口創(chuàng)匯（吳玉娟 等，2018）。目前，莖枯病的防治方法以化學(xué)防治為主，但是長時(shí)間使用單一化學(xué)藥劑，病菌的抗藥性增強(qiáng)，常規(guī)殺菌劑的防治效果持續(xù)降低（Shi et al.，2020）；并且出口產(chǎn)品對農(nóng)藥殘留的檢測極其嚴(yán)格，亟需篩選高效、低毒、低殘留的殺菌劑用于蘆筍莖枯病的防治。

生物農(nóng)藥通常具有中低毒、無污染的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。而利用植物自身抗病性是作物病害綜合防治中最有效、最經(jīng)濟(jì)的措施（Hadwiger，2013；Zhang et al.，2017）。因此，本試驗(yàn)在常見生物殺菌劑枯草芽孢桿菌、多抗霉素以及春雷霉素的基礎(chǔ)上增加了香菇多糖和氨基寡糖素兩種植物誘抗劑，明確了5種生物農(nóng)藥對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的毒力，檢測了其對蘆筍的安全性，通過田間藥效試驗(yàn)明確其用量和防治效果，探討生物農(nóng)藥替代化學(xué)藥劑的可能性，為生物農(nóng)藥用于蘆筍莖枯病的綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：天門冬擬莖點(diǎn)霉菌，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系從發(fā)病蘆筍病莖上分離、鑒定并保存。

供試藥劑：85%氨基寡糖素原藥，5%氨基寡糖素水劑，10%香菇多糖原藥，2%香菇多糖水劑，70%春雷霉素原藥，6%春雷霉素可溶液劑，34%多抗霉素原藥，5%多抗霉素水劑，含孢子1 000億個(gè)·g-1的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑；對照藥劑：97%苯醚甲環(huán)唑原藥，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑。以上藥劑均由山東省農(nóng)藥檢定所提供。

供試蘆筍品種：京綠1號，購自泰安市泰山區(qū)豐收種子站。

試驗(yàn)儀器：電子分析天平、移液槍、3WBD-16型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器（北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司）、生化培養(yǎng)箱等。

田間藥效試驗(yàn)于2018年7月、2019年7月在泰安市岱岳區(qū)徂徠鎮(zhèn)北望村進(jìn)行。試驗(yàn)田土質(zhì)為砂質(zhì)壤土，試驗(yàn)小區(qū)的栽培管理?xiàng)l件均一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測定 將原藥分別用丙酮溶解，加入無菌水進(jìn)行稀釋，制成10 mg·mL-1的母液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將各母液依次稀釋，加入PDA培養(yǎng)基中，分別配成200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的氨基寡糖素培養(yǎng)基，32、16、8、4、2、1 μg·mL-1的苯醚甲環(huán)唑培養(yǎng)基，200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的多抗霉素培養(yǎng)基，120、60、30、15、7.5、3.75 μg·mL-1的春雷霉素培養(yǎng)基，200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1的香菇多糖培養(yǎng)基以及2 × 107、1 × 107、5 × 106、2.5 × 106、1.25 × 105、6.25 × 104cfu·mL-1的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基，以無藥平板作對照，每個(gè)濃度4次重復(fù)。采用菌絲生長速率法，先將天門冬擬莖點(diǎn)霉菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后將其接種到含藥平板上，生化培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃黑暗培養(yǎng)96 h，采用十字交叉法量取菌落直徑，計(jì)算生長速率抑制率，采用DPS軟件計(jì)算毒力回歸方程、EC50值。

培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，挑取單菌落斑點(diǎn)于液體LB培養(yǎng)基中過夜，恒溫振蕩培養(yǎng)制備種子液。以1%的接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)箱中恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，使用預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌液體LB培養(yǎng)基將發(fā)酵液濃度調(diào)整為1 × 1010cfu·mL-1，依次稀釋為1 × 109、1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105cfu·mL-1。打取病原菌菌餅（d=5 mm），置于PDA平板中央，使用移液槍分別吸取上述梯度濃度發(fā)酵液1 μL，置于病原菌菌餅兩側(cè)1.5 cm處，以加入1 μL無菌水為對照，將培養(yǎng)皿倒扣培養(yǎng)于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待對照平板上面的菌絲長至整個(gè)平皿直徑的3/4處時(shí)，測量抑菌圈大小。

生長抑制率=〔1 -（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）〕 × 100%

1.2.2 5種生物農(nóng)藥對蘆筍植株的安全性評價(jià) 參照NY/T 1965.1—2010《農(nóng)藥對作物安全性評價(jià)準(zhǔn)則第1部分：殺菌劑和殺蟲劑對作物安全性評價(jià)室內(nèi)試驗(yàn)方法》測定5種藥劑對蘆筍植株的安全性，以推薦的田間藥效試驗(yàn)最高劑量為最低試驗(yàn)劑量，按1、2、4倍劑量的梯度設(shè)計(jì)處理劑量。在溫度（22 ± 3）℃，濕度65%，光周期14 h/10 h的日光溫室內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)藥劑田間試驗(yàn)有效成分量，設(shè)5%氨基寡糖素AS 40、80、160 mL ·（667 m2）-1，2%香菇多糖AS 50、100、200 mL ·（667 m2）-1，6%春雷霉素SL 45、90、180 mL ·（667 m2）-1，5%多抗霉素AS 90、180、360 mL ·（667 m2）-1，含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP 40、80、160 g ·（667 m2）-1以及清水對照，每處理4次重復(fù)，每重復(fù)10盆，每盆1株。選擇苗期生長一致的蘆筍植株進(jìn)行整株噴霧，用水量60 L ·（667 m2）-1。藥后每天觀察蘆筍生長情況；藥后15 d用布卷尺測量蘆筍株高，檢查生長狀況，計(jì)算生長速率抑制率和安全系數(shù)。

生長速率抑制率=（空白對照生長速率-藥劑處理生長速率）/空白對照生長速率 × 100%

安全系數(shù)=藥劑對作物的最大無影響試驗(yàn)劑量/藥劑田間最高推薦使用劑量

1.2.3 田間藥效試驗(yàn) 藥劑設(shè)計(jì)：CK（清水對照），5%氨基寡糖素AS 20、30、40 mL ·（667 m2）-1，2%香菇多糖AS 30、40、50 mL ·（667 m2）-1，6%春雷霉素SL 25、35、45 mL ·（667 m2）-1，5%多抗霉素AS 70、80、90 mL ·（667 m2）-1，含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP 20、30、40 g ·（667 m2）-1，10%苯醚甲環(huán)唑WG 48 g ·（667 m2）-1；每處理4次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積30 m2。

于蘆筍莖枯病發(fā)病前或零星發(fā)病時(shí)進(jìn)行整株噴霧，莖部主要著藥，隨水噴施藥劑，用水量60 L ·（667 m2）-1，7 d后進(jìn)行第2次噴藥。處理后7、14 d記錄發(fā)病情況。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5點(diǎn)進(jìn)行取樣調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查20株植株的病害發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。病害調(diào)查參照賈海民等（2010）的方法。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，整株無病斑；1級，主莖病斑繞莖長度占主莖周長25%以下，或側(cè)枝發(fā)病量占總側(cè)枝的25%以下；2級，主莖病斑繞莖長度占主莖周長25%～50%（含），或側(cè)枝發(fā)病量占總側(cè)枝的25%～50%（含）；3級，主莖病斑繞莖長度占主莖周長50%～75%（含），或側(cè)枝發(fā)病量占總側(cè)枝的50%～75%（含）；4級，主莖病斑繞莖長度占主莖周長75%以上，或側(cè)枝發(fā)病量占總側(cè)枝的75%以上。

病情指數(shù)=∑（病級株數(shù) × 該病級值）/（檢查總株數(shù) × 最高級數(shù)值）× 100

防治效果=（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù) × 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 5種生物農(nóng)藥對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的室內(nèi)毒力測定

從表1可以看出，香菇多糖及氨基寡糖素對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌沒有明顯的抑制活性；對照藥劑苯醚甲環(huán)唑的EC50值為4.239 μg·mL-1，室內(nèi)毒力較高，春雷霉素、多抗霉素的EC50值分別為60.184、86.438 μg·mL-1，枯草芽孢桿菌的EC50值為7.134 × 106cfu·mL-1?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵液濃度在1 × 108cfu·mL-1時(shí)對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌抑制效果最好，抑菌圈直徑為10.05 mm（表2）。

表1 5種生物農(nóng)藥對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的室內(nèi)毒力測定

表2 枯草芽孢桿菌對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的室內(nèi)活性

2.2 5種生物農(nóng)藥對蘆筍植株的安全性評價(jià)

從表3可以看出：各處理植株在施藥后3 d和15 d均無藥害癥狀出現(xiàn)。施藥后15 d，與對照相比，80、160 g ·（667 m2）-1枯草芽孢桿菌WP對蘆筍株高生長量有顯著抑制作用，200 mL ·（667 m2）-1香菇多糖AS對株高生長量有顯著促進(jìn)作用，其他處理株高生長量與對照無顯著差異。表明5種生物農(nóng)藥田間試驗(yàn)劑量對蘆筍生長安全。

表3 5種生物農(nóng)藥對蘆筍生長的影響

2.3 5種生物農(nóng)藥對蘆筍莖枯病的田間防效

由表4可知，隨著藥劑濃度的提高，各處理對蘆筍莖枯病的防治效果也在上升。2018年試驗(yàn)中，藥后7 d，5種生物農(nóng)藥田間試驗(yàn)的高劑量防治效果與對照藥劑10%苯醚甲環(huán)唑WG差異均不顯著，平均為75.16%～82.53%；2019年試驗(yàn)中，藥后7 d，2%香菇多糖AS、5%氨基寡糖素AS、含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP田間高劑量的防治效果分別為69.89%、69.81%、72.75%，顯著高于對照藥劑10%苯醚甲環(huán)唑WG，6%春雷霉素SL、5%多抗霉素AS高劑量防治效果與對照藥劑差異不顯著。綜合兩年試驗(yàn)結(jié)果，施藥后7 d，5種生物農(nóng)藥高劑量的防效與對照化學(xué)殺菌劑苯醚甲環(huán)唑相當(dāng)，這5種生物農(nóng)藥對蘆筍莖枯病的田間防治效果均較好。2018年含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP、2%香菇多糖AS以及5%氨基寡糖素AS田間試驗(yàn)高劑量的藥后14 d防效可達(dá)66%以上；2019年含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP、2%香菇多糖AS以及5%氨基寡糖素AS田間試驗(yàn)高劑量的藥后14 d防效可達(dá)54%以上，均顯著高于對照藥劑，表現(xiàn)出良好的持效性，且在本試驗(yàn)條件下，幾種藥劑對非靶標(biāo)生物較為安全。

表4 5種生物農(nóng)藥對蘆筍莖枯病的田間防治效果

3 結(jié)論與討論

室內(nèi)毒力試驗(yàn)表明，氨基寡糖素和香菇多糖對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌沒有直接抑制活性，春雷霉素和多抗霉素的毒力比對照藥劑苯醚甲環(huán)唑低。杜宜新等（2013）報(bào)道了20種農(nóng)藥對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的室內(nèi)毒力，其中氨基寡糖素對天門冬擬莖點(diǎn)霉菌無室內(nèi)活性，本試驗(yàn)結(jié)果一致；孫燕芳等（2013）報(bào)道了春雷霉素對病原菌的室內(nèi)毒力較低，也與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但是這2個(gè)試驗(yàn)均未進(jìn)行后續(xù)安全性和大田試驗(yàn)，也就無法確定這些藥劑對蘆筍莖枯病的實(shí)際防治效果。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了5種生物農(nóng)藥的安全性與田間藥效試驗(yàn)。結(jié)果表明，高濃度枯草芽孢桿菌對蘆筍株高具有抑制作用，其他藥劑對蘆筍生長安全，高濃度香菇多糖對蘆筍植株的株高還有一定的促進(jìn)作用，與李鵬鵬等（2014）報(bào)道的香菇多糖促進(jìn)黃瓜幼苗生長的結(jié)果一致。

兩年田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，5種生物農(nóng)藥對蘆筍莖枯病均具有良好的防治效果，2018年藥后7 d田間高劑量防效平均為75.16%～82.53%；蘆筍莖枯病在降雨多的時(shí)期發(fā)病重，發(fā)病高峰期一般在雨后7 d（許傳征和蔣學(xué)杰，2020），2019年多陰雨天氣，5種藥劑田間高劑量平均防效均在65%以上；藥后14 d，含孢子1 000億個(gè)·g-1枯草芽孢桿菌WP 40 g ·（667 m2）-1、2%香菇多糖AS 50 mL ·（667 m2）-1以及5%氨基寡糖素AS 40 mL ·（667 m2）-1防治效果顯著高于對照藥劑，持效期較長，可以用于蘆筍莖枯病的防治。并且生物農(nóng)藥具有中低毒、安全、無污染的優(yōu)點(diǎn)，符合農(nóng)藥高效、低毒的發(fā)展方向，契合我國的可持續(xù)發(fā)展理念，應(yīng)當(dāng)被大力推廣（王巖，2020）。

綜上，5種生物農(nóng)藥均可用于蘆筍莖枯病的綠色防控，其中枯草芽孢桿菌WP在田間推薦最大劑量的2倍及以上時(shí)〔80、160 g ·（667 m2）-1〕使用會(huì)抑制蘆筍生長，需嚴(yán)格控制使用劑量。2%香菇多糖AS 50 mL ·（667 m2）-1、5%氨基寡糖素AS 40 mL ·（667 m2）-1對蘆筍安全，防治效果好且持效期較長，推薦取得登記后用于蘆筍莖枯病的綠色防控。