右美托咪定對(duì)原代皮層神經(jīng)元鐵死亡相關(guān)蛋白BECN1、PBECN1、GPX4、ACSL4 表達(dá)的影響

李遙，楊馮睿，梁峰，侯嬌艷，楊艷

（南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 麻醉科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

0 引言

鐵死亡（FerroPtosis）是近年發(fā)現(xiàn)的不同于細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞壞死的一種新的細(xì)胞死亡形式。急性腦損傷后，神經(jīng)元表現(xiàn)出鐵死亡相關(guān)的分子特征[1]。而且，鐵死亡在帕金森綜合征、阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的病理發(fā)展中扮演重要角色[2-3]。右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）是臨床麻醉中常用的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，通過(guò)抑制交感神經(jīng)活動(dòng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用。有研究報(bào)道Dex通過(guò)JAK2/STAT3途徑抵抗神經(jīng)元凋亡[4]。但Dex的神經(jīng)元保護(hù)作用是否涉及鐵死亡過(guò)程還未清楚。本研究采用Erastin誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元鐵死亡，探討Dex是否能夠鐵死亡導(dǎo)致的細(xì)胞活力喪失，并觀察鐵死亡相關(guān)蛋白BECN1、GPX4、ACSL4的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 大鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)。Wistar大鼠由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心提供。參照Sahu M P[5]等方法進(jìn)行皮層原代神經(jīng)元提取及培養(yǎng)。雌性大鼠交配受孕后獨(dú)立飼養(yǎng)18 d用于皮層神經(jīng)元提取。大鼠處死后用70%乙醇消毒，然后切開(kāi)腹腔從子宮中取出胚胎，將胚胎轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，剪下頭部并立即轉(zhuǎn)移到4℃的PBS中。在解剖顯微鏡下分離大腦皮層部分，切成微小塊，然后用0.2%（w/v）木瓜蛋白酶（P3125，Sigma）和0.004%（w/v）DNase溶液（D7073，Beyotime）于37℃消化30 min。將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將其接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，接種密度為106個(gè)/mL。每72 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 神經(jīng)元鐵死亡誘導(dǎo)及右美托咪定干預(yù)處理。將神原代經(jīng)元細(xì)胞重新接種到孔板，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin購(gòu)于Selleck公司，貨號(hào)為S7242，將Erastin溶于DMSO，終濃度為50μM[6]。右美托咪定（江蘇恩華制藥）在Erastin處理后1 h加入，終濃度為1μM。培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)和蛋白免疫印跡分析。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)。將神經(jīng)元細(xì)胞接種到96孔板，將MTT（M8180，Solarbio）粉末溶解在PBS中至終濃度為5 mg/mL，每孔加入20 μL該溶液。在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，再加入150 μL DMSO，孵育15 min。將平板在避光的振蕩器上攪拌，并測(cè)量490 nm處的吸光度。細(xì)胞活力以實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白對(duì)照孔OD值表示。

1.4 蛋白免疫印跡。收集藥物處理后的神經(jīng)元用蛋白裂解液（P0013C，Beyotime）裂解，蛋白定量后取50μg蛋白于12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗（GPX4，BM5231，BOSTER；Beclin1，BA3123-2，BOSTER；P-Beclin1（Ser93），14717，CST；ACSL4，A04372-2，BOSTER；GAPDH，BM1623，BOSTER）孵育過(guò)夜。然后用二抗（HRP-mouseIgG；HRPRabbitIgG）在室溫下孵育1h。最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（ChemiDoxXRS，Bio-Rad）觀察免疫印跡。采用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Dex處理對(duì)Erastin誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元鐵死亡的影響。神經(jīng)元追蹤顯示，相對(duì)于DMSO組，Er組在24 h神經(jīng)元胞及神經(jīng)突降解，神經(jīng)元死亡；Dex干預(yù)后48 h內(nèi)（Er+Dex組），神經(jīng)元胞體和神經(jīng)突雖受損，但仍維持神經(jīng)元形態(tài)。細(xì)胞活力檢測(cè)顯示，Er組相對(duì)于DMSO組其細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.001），Er+Dex組相對(duì)于Er組其細(xì)胞活力顯著增高（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 原代皮層神經(jīng)元追蹤及細(xì)胞活力檢測(cè)

2.2 鐵死亡相關(guān)蛋白BECN1、PBECN1、GPX4、ACSL4表達(dá)水平。結(jié)果顯示，DMSO組、Er組和Er+Dex組的ACSL4、BECN1的表達(dá)水平均無(wú)差異。而Er組相對(duì)于DMSO組GPX4表達(dá)顯著降低（P＜0.001），Er+Dex組相對(duì)于Er組GXP4表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。Er組相對(duì)于DMSO組PBECN1表達(dá)顯著升高（P＜0.001），Er+Dex組相對(duì)于Er組GXP4表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖2 鐵死亡相關(guān)蛋白BECN1、PBECN1、GPX4、ACSL4的表達(dá)

3 討論

鐵死亡以其鐵離子依賴的氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡而命名。腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡不但涉及凋亡、壞死、焦亡等經(jīng)典的細(xì)胞死亡途徑，也涉及最新發(fā)現(xiàn)的鐵死亡[7]。Dex作為臨床麻醉常用的鎮(zhèn)靜劑，對(duì)腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。LIU等[8]發(fā)現(xiàn)Dex通過(guò)調(diào)控miR-214表達(dá)升高抑制ROCK1水平，進(jìn)一步抑制NF-κB從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。WANG等[9]證實(shí)通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥，改善神經(jīng)元凋亡。ZHANG等[10]發(fā)現(xiàn)Dex通過(guò)上調(diào)HSP70抑制創(chuàng)傷性腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。本研究中，Dex處理后可改善Erastin誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。事實(shí)上，Dex也可以減輕敗血癥導(dǎo)致的心肌細(xì)胞鐵死亡[11]。因此，Dex的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能涉及鐵死亡途徑。

進(jìn)一步，我們檢測(cè)了鐵死亡相關(guān)蛋白BECN1、PBECN1、GPX4、ACSL4的表達(dá)水平。BECN1磷酸化后與膜蛋白SLC7A11結(jié)合，抑制System Xc-的形成，從而誘發(fā)鐵死亡[12]。GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵因子，促進(jìn)GPX4的表達(dá)可有效抑制鐵死亡的發(fā)生[13]。ACSL4有助于鐵死亡過(guò)程中脂質(zhì)中間體的積累，故ACSL4 具有促進(jìn)鐵死亡的作用[14]。本研究中，Erastin未引起ACSL4的表達(dá)變化，而GPX4的表達(dá)降低，磷酸化的BECN1表達(dá)升高，提示Dex的抗鐵死亡作用可能是通過(guò)BECN1-GPX4途徑實(shí)現(xiàn)的[15]。本研究從鐵死亡角度探討Dex的神經(jīng)保護(hù)作用，證實(shí)了Dex可通過(guò)調(diào)控鐵死亡相關(guān)蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。