以紅蕓豆與黃豆為氮源的枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵代謝組學(xué)比較分析

高安平，龔愛華

（江蘇省太倉市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 太倉 215400）

0 引言

納豆通常以黃豆為原料，經(jīng)枯草芽孢桿菌在適宜條件下發(fā)酵制成的豆制品，其有效成分納豆激酶（Nattokinase，簡稱NK），是在發(fā)酵過程中由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，能特異性水解纖維蛋白，從而溶解血栓[1]。

目前，納豆激酶主要使用黃豆作為氮源來生產(chǎn)，但黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中嘌呤含量高，限制了痛風(fēng)患者的使用。為此，本研究以紅蕓豆為培養(yǎng)基氮源，使用代謝組學(xué)方法，比較分析紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的差異。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料。菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室分離，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14434；材料：紅蕓豆及黃豆，市售；纖維蛋白原、凝血酶（2000 U/mg）購于沈陽拜英生物技術(shù)有限公司；尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（1240IU/瓶）購于中國食品藥品檢定研究院；氯化鈉、磷酸二氫鉀、NaOH等試劑為分析純；乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制：LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，酵母粉1%，PH 7.0。LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，酵母粉1%，瓊脂粉2%，PH 7.0。紅蕓豆發(fā)酵培養(yǎng)基：紅蕓豆粉2%，葡萄糖4%，氯化鈉1.5%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值為7.0，均為w/v。黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉2%，葡萄糖4%，氯化鈉1.5%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值為7.0，均為w/v。以上培養(yǎng)基均經(jīng)121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 種子液制備：菌種活化：取30μL保存于-80℃的甘油菌接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，225rpm，培養(yǎng)6 h。四區(qū)劃線接種LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)15h，挑取單菌落，接種3 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，225rpm培養(yǎng)6 h，得菌種子液。

1.2.3 粗酶液制備：將種子液接種到pH值為7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2%，在37℃，225rpm的條件進行發(fā)酵，第72 h取樣檢測。

1.2.4 納豆激酶活性檢測：納豆激酶活性采用纖維蛋白平板法進行檢測，該方法于1952年由Astrup等人建立[2]。具體操作如下：將200μL纖維蛋白原溶液與60μL凝血酶溶液加入30 mL瓊脂糖溶液（1%）中，充分混勻，倒入平板，室溫放置1 h，形成纖維蛋白凝塊；用打孔器在纖維蛋白板上打孔，每孔加酶液10μL，置于37℃反應(yīng)15 h，取出后測定各溶解圈的垂直兩直徑，計算溶圈面積。以尿激酶的溶圈面積為橫坐標(biāo)，尿激酶濃度為縱坐標(biāo)，制作尿激酶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)求出樣品的酶活力大小。

1.2.5 嘌呤含量檢測：樣品制備：發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液于離心管中，12000 g離心10 min，取上清，經(jīng)凍干機凍干，即制得樣品。稱取一定量樣品于10 mL離心管，加2 mL+3.0%高氯酸溶液，快速混勻，100℃水浴60 min，冷卻后，使用2M氫氧化鉀調(diào)pH至7.0，再使用5.0%甲酸調(diào)pH至3.6，使用10 mm甲酸銨溶液（pH3.6）定容至10 mL，混勻，過0.22μm濾膜后待測。色譜條件：色譜柱為Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm×5μm）；柱溫：30℃；流動相：10 mm甲酸銨（pH3.6）和甲醇（99%∶1%）；進樣量：10μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm。

1.2.6 代謝組學(xué)分析：樣品制備：發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液于離心管，12000 g離心10 min，取上清，凍干機凍干，即制得樣品。稱取50 mg樣品至5 mL離心管中，加入一顆直徑6 mm的研磨珠；加入400μL提取液（甲醇：水=4∶1（v∶v）），使用冷凍組織研磨儀研磨6 min（-l0℃，50 Hz）；低溫超聲提取30 min（5℃，40 KHz），樣品靜置于-20℃，30 min；離心15 min（12000 g，4℃），取上清液上機分析。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，l.8μm；Waters，Milford，USA）；流動相A為95%水+5%乙腈（含0.1% 甲酸），流動相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1% 甲酸）；流速為0.40 mL/min，進樣量為2μL，柱溫為40℃。質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。

2 結(jié)果

2.1 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中納豆激酶活性高。分別取1 mL紅蕓豆與黃豆發(fā)酵液于1.5 mLEP管中，12000 g離心5 min取上清，檢測到納豆激酶活性分別為13340 U/mL和9772 U/mL，紅蕓豆發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的納豆激酶活性顯著高于黃豆發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的納豆激酶活性。如圖1所示。

圖1 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物納豆激酶活性比較

2.2 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中嘌呤含量極低。經(jīng)檢測，紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物嘌呤含量僅為4.17 mg/100 g，為低嘌呤產(chǎn)品，適用于痛風(fēng)患者。黃豆為氮源生產(chǎn)的納豆激酶中嘌呤含量報道為110.4 mg/100 g[3]。如圖2所示。

圖2 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物嘌呤含量檢測

2.3 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物差異較大。收集質(zhì)譜信號繪制Venn圖，陰離子模式下，紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共有62種差異代謝物，陽離子模式下共有24種差異代謝物（圖3A）。紅蕓豆培養(yǎng)基的差異代謝物主要包含了含氧有機化合物、孕烯醇酮脂類及黃酮類物質(zhì)，黃豆培養(yǎng)基的差異代謝物主要包含了類固醇類物質(zhì)及其衍生物、脂肪酸、羧酸及其衍生物（圖3B）。

圖3 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物差異分析

2.4 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中富含更多有益成分。對差異代謝物進行代謝物聚類分析，如圖4所示。本研究選取了表達豐度前50的數(shù)據(jù)，相較于黃豆培養(yǎng)基，發(fā)酵后紅蕓豆培養(yǎng)基中共有30種代謝物含量較高，包括：圣草苷、透明質(zhì)酸、兒茶素、谷胱甘肽及三萜類化合物。發(fā)酵后的黃豆培養(yǎng)基中共有20種代謝物含量較高，主要為類固醇物質(zhì)與脂肪酸。

圖4 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物聚類分析

3 討論

納豆激酶作為一款安全有效的溶栓產(chǎn)品已廣泛使用，但由于用黃豆生產(chǎn)出的產(chǎn)品中嘌呤含量為110.4 mg/100 g，限制了痛風(fēng)患者的使用[4]。

本研究使用紅蕓豆為氮源生產(chǎn)納豆激酶，其中嘌呤含量降至4.17 mg/100 g，活性提高為13340 U/mL。此外，相較于黃豆，以紅蕓豆為氮源代謝物中富含透明質(zhì)酸、兒茶素、谷胱甘肽、三萜類化合物，對維持人體健康具有更加積極的作用[5-6]。

4 結(jié)論

本研究通過比較紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活性、嘌呤含量以及代謝組學(xué)分析，首次證明了紅蕓豆是優(yōu)于黃豆的納豆激酶生產(chǎn)原料，為使用紅蕓豆為原料生產(chǎn)納豆激酶提供了有力的依據(jù)。