羥乙基殼聚糖基Pickering 乳液制備及靜電紡絲工藝優(yōu)化

侯婷婷，楊 倩，李程鵬，邱洪茂，羅曉燕

（廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088）

靜電紡納米纖維是通過高壓電場的“牽引力”使高分子溶液噴射并固化而形成的一種新型納米材料，具有貫通的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、豐富的孔隙和高的比表面積，可快速吸收傷口的滲液[1]，其成型過程受電壓、溶液黏度、溶液推進(jìn)速度、接收板距離和表面張力等多種因素影響[2]。羥乙基殼聚糖（HCS）是一種源于海洋節(jié)肢動物甲殼的天然多糖衍生物，具有良好的生物相容性和黏附性，廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面敷料等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3-4]，但其靜電紡絲性能很差，需要添加助紡劑。部分水解的聚乙烯醇（PVA）分子鏈柔順、表面張力低，是一種優(yōu)良的助紡劑，且其具有良好生物相容性，已被美國FDA認(rèn)證列入醫(yī)用輔料[2]。同時HCS 抗菌性能很差，不能滿足于傷口的臨床需求。近年來，耐藥菌株的大量出現(xiàn)加劇了感染傷口愈合的難度，需要聯(lián)合使用抗菌劑來大幅減小致病菌繼發(fā)耐藥的概率[5]。

單軸靜電紡可實(shí)現(xiàn)納米纖維對溶解性能相似的抗菌成分的包埋，而溶解性能不同的活性成分僅可通過同軸和乳液靜電紡絲法來制備。與同軸電紡相比，乳液紡只需要控制單一紡絲噴嘴的參數(shù)，操作過程明顯簡化[6]。皮克林（Pickering）乳液是一種以固體納米顆粒作為乳化劑的新型乳液[7]，具有毒性低、穩(wěn)定性好和泡沫少的優(yōu)點(diǎn)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，竹筍膳食纖維穩(wěn)定的Pickering 乳液可保持至少4周的穩(wěn)定性[9]。但目前鮮見Pickering 乳液靜電紡的報道，僅有Cai 等[10]通過油包水Pickering 乳液實(shí)現(xiàn)納米纖維對鹽酸萬古霉素的包封。

納米抗菌材料如銀納米粒子（AgNPs）和納米氧化鋅（ZnO）等具有多重殺菌機(jī)制，可廣泛應(yīng)用于各種殺菌場合。其中，AgNPs 殺菌性能優(yōu)良，且不會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[11-12]，但其毒性限制了臨床應(yīng)用。最新研究表明，螯合效應(yīng)會延緩銀納米復(fù)合物中AgNPs 的釋放，使得其對人胚腎細(xì)胞幾乎不顯示毒性作用[13]。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs 與聚多巴胺（PDA）的結(jié)合非常牢固，并具備典型的長效緩釋和低毒性[14]。茶樹精油（TTO）是一種優(yōu)良的天然抗菌劑[15]，但TTO 存在易揮發(fā)和水溶性差的缺點(diǎn)，極大限制其應(yīng)用范圍[16]。鑒于此，本研究首先采用ZnO 為前體，通過PDA 黏附和還原法，制備ZnO/Ag 復(fù)合粒子（ZA）。隨后，以ZA 為乳化劑、TTO 為油相、HCS 溶液為水相，制備Pickering乳液；通過助紡劑PVA 的引入和紡絲實(shí)驗(yàn)條件（電壓、聚乙烯醇PVA 用量和接收距離）的優(yōu)化，獲得負(fù)載多種活性抗菌組分的納米纖維敷料，以期拓展殼聚糖基功能納米纖維材料在感染傷口中的應(yīng)用，為開發(fā)具有多重抗菌機(jī)制的海洋多糖基創(chuàng)面敷料提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

納米ZnO 分散液（ZnO 粒徑30 nm）、鹽酸多巴胺、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、PVA、氨水，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；羥乙基殼聚糖（HCS），山東萊州市海生物制品有限公司；硝酸銀（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；TTO，江西康盛堂藥業(yè)有限公司；金黃色葡萄球菌（菌種編號：ATCC 6538）、大腸埃希菌（菌種編號ATCC 8739），廣東省微生物菌種保藏中心。

NTV-79 旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（上海尼潤智能科技有限公司）；HD-23335 型靜電紡絲設(shè)備（北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司）；Bruker D8 型 X 射線衍射儀（Cu 靶 Kα，Cu 特征譜線波長λ=0.154 0 nm）；QUANTA FEG 450 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡SEM（美國FEI 公司）；Talos F200X 型透射電子顯微鏡TEM（美國FEI 公司）；X-Max 型X 射線能譜分析XRD（英國牛津公司）；MP41-顯微鏡（廣州市明美廣電技術(shù)有限公司）；Nicolet-iS10 型傅里葉變換紅外光譜分析FTIR（美國FEI 公司）。

1.2 納米ZnO/Ag 復(fù)合粒子的制備和表征

根據(jù)Liang 等[14]方法，本研究分別通過PDA黏附改性和原位還原法制備ZA。取液體ZnO 溶液12.50 g，加入一定量蒸餾水中，并調(diào)節(jié)混合溶液體積為50 mL，冰浴超聲分散10 min（超聲4 s，間歇5 s）后，待用。配制10 mmol/L Tris 溶液，并用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)其pH 值為8.5。取1.20 g 鹽酸多巴胺，溶解于上述2 mg/mL Tris 緩沖液中。最后向多巴胺溶液中緩慢加入納米ZnO 水分散液，再次冰浴超聲分散2 min（超聲4 s，間歇5 s）。所得混合液在室溫下攪拌反應(yīng)3 h。停止反應(yīng)后，反應(yīng)液以8 000 r/min 離心10 min，用蒸餾水多次洗滌。然后將所得沉淀冷凍干燥12 h，得到聚多巴胺改性納米復(fù)合粒子（ZnO/PDA）。

另取6.00 g AgNO3溶解于550 mL 溶液中，在攪拌狀態(tài)下逐滴緩慢加入氨水，硝酸銀溶液由澄清轉(zhuǎn)為渾濁，繼續(xù)滴加氨水至溶液正好澄清，得到銀氨溶液。稱取ZnO/PDA 納米復(fù)合粒子3.00 g 于50 mL 蒸餾水中，冰浴超聲分散3 min（超聲4 s，間歇5 s），后緩慢加至銀氨溶液中?；旌弦涸谑覝叵?00 r/min 攪拌30 min。停止反應(yīng)后，反應(yīng)液8 000 r/min 離心10 min，用蒸餾水多次洗滌。然后將所得沉淀冷凍干燥12 h，得到納米ZnO/Ag（ZA）復(fù)合粒子。

采用FTIR、XRD 和TEM 對三種納米粒子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和微觀形貌進(jìn)行表征，使用NanoMeasurer 1.2 測量軟件統(tǒng)計(jì)3 張不同視野透射電鏡圖中納米粒子的平均粒徑及分布。

1.3 Pickering 乳液穩(wěn)定性研究

1.3.1Pickering 乳液的制備 以ZA 納米復(fù)合粒子作為固體乳化劑制備Pickering 乳液。將一定量ZA納米復(fù)合粒子冰浴超聲分散1 min（超聲4 s，間歇5 s）于蒸餾水中，加入一定量的TTO，手搖30 s得到Pickering 乳液。通過改變固體乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和油相占總體積比（10%、20%、30%、40%、50%、60%），優(yōu)化得到ZA 穩(wěn)定Pickering 乳液的最佳原料配比。Pickering 乳液總體積為6 mL，在探討固體乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響時固定油相體積分?jǐn)?shù)為40%，探討油相體積分?jǐn)?shù)時固定固體乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。將所制備的乳液轉(zhuǎn)移至西林瓶中，靜止48 h 后觀察乳液穩(wěn)定性。

1.3.2Pickering 乳液特性研究 采用滴入法判斷皮克林乳液的類型，即取一滴乳液滴入去離子水中，攪拌后如果乳液液滴擴(kuò)散開來，說明乳液為水包油O/W 型乳液；反之，未擴(kuò)散開，并漂浮于水面上，說明乳液為油包水W/O 型乳液。使用光學(xué)顯微鏡對乳液進(jìn)行微觀形態(tài)的測量。所有乳液樣品稀釋1～2 倍，滴加1～2 滴稀釋后的乳液至載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，液滴的粒徑用軟件NanoMeasurer 1.2測量，計(jì)算得到其平均直徑。通過觀察靜置西林瓶中乳液的分層狀況判斷乳液穩(wěn)定性，并且用乳析指數(shù)（Creaming index，CI）對乳化程度進(jìn)行測量。乳液在室溫下儲存，24 h 后對樣品進(jìn)行觀察。在儲存期間，乳液變成不透明的乳液層和透明的溶劑層，將透明溶劑層和總?cè)橐簩拥母叨缺硎緸镠s和He。乳析指數(shù)通過以下方程計(jì)算可得：CI（%）=（Hs/ He）。

1.4 靜電紡絲纖維膜的制備及表征

1.4.1紡絲液動力黏度的測定 使用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定紡絲液的動力黏度。在25 ℃下，選用E 轉(zhuǎn)子（測量范圍100～ 10 000 mPa?s，轉(zhuǎn)速750 r/min）。將樣品溶液倒入黏度計(jì)量杯中，測量并記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果取3 次平均值。

1.4.2纖維成形的影響 在1.3 節(jié)基礎(chǔ)上，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HCS 水溶液（實(shí)驗(yàn)中可獲得的最大濃度）為水相，TTO 為油相，ZA 作為穩(wěn)定劑，制備Pickering 乳液。為提高可紡性，添加一定量的PVA溶液為紡絲液（控制最終水相中PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、7.5%和10%），得到PVA/HCS/ZA/TTO 紡絲液，用于靜電紡絲。紡絲條件為：室內(nèi)溫度（26±2）℃，相對濕度30%～ 40%。靜電紡絲注射器規(guī)格為2.5 mL，20 號針頭（內(nèi)徑為0.6 mm）推進(jìn)速度0.07 mm/min，負(fù)壓1.5 kV。研究電壓對納米纖維形貌的影響時，接收距離固定為15 cm，設(shè)定電壓為16、18、20、22 和24 kV。研究接收距離納米纖維形貌的影響時，固定電壓為16 kV，接收距離定為10、12 和15 cm。為對比研究ZA 和TTO對納米纖維的形貌影響，實(shí)驗(yàn)中將不含ZA 與TTO的納米纖維（即PVA/HCS）作為空白組和不含TTO的納米纖維（即PVA/HCS/ZA）作為對照組。

1.4.3靜電紡絲纖維膜的表征 采用光學(xué)顯微鏡和SEM 觀察電紡絲纖維的微觀形貌，采用紅外光譜分析PVA/HCS/ZA/TTO 纖維膜中茶樹油的特征吸收峰，通過采用 EDS 法測量分析PVA/HCS/ZA/TTO 纖維膜中納米銀顆粒的含量。

1.5 靜電紡絲纖維膜的特性研究

1.5.1水蒸氣透過率的測定 量取一定量的蒸餾水于離心管（截面積為A）中，將裁剪成適合大小的樣品置于離心管上方并固定，四周封牢，密封杯口，使蒸餾水液面與樣品之間留有一定的空隙，稱重并記錄離心管、蒸餾水和樣品的質(zhì)量，記為m0；將離心管放入溫度為37 ℃的恒溫箱中，24 h 后取出離心管，重新稱重并記錄離心管、蒸餾水和樣品的質(zhì)量，記為mt；水蒸氣透過率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算，單位為g/（cm2?d）。

1.5.2抗菌性能測試 采用抑菌圈法評價復(fù)合纖維膜（PVA/HCS、PVA/HCS/ZA 和PVA/HCS/ZA/TTO）與納米粒子（ZnO、ZnO/PDA 和ZA）的抑菌性能。取金黃色葡萄球菌（或大腸桿菌）于大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 震蕩培養(yǎng)18 h 后，用TSB 稀釋至106～107CFU/mL。實(shí)驗(yàn)前，將剛紡好的纖維以及納米顆粒水溶液（40 mg/mL）紫外輻射滅菌2 h。1 mL 準(zhǔn)備好的菌懸液（106～107CFU/mL）與10 mL 大豆瓊脂混合后傾倒于培養(yǎng)基中，待凝固后貼上直徑為6 mm 的濾紙片（已滅菌），并分別在濾紙片上滴加10 μL 的納米纖維和納米粒子水溶液，靜止30 min 后倒放培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，從4 個方位測量抑菌圈直徑，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑大于20 mm，抗菌活性為極敏；15～20 mm，抗菌活性為高敏；10～15 mm，抗菌活性為中敏；7～9 mm，抗菌活性為低敏；小于7 mm，抗菌活性不敏感[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZA 制備和表征

圖1_a 為ZnO、ZnO/PDA 和ZA 的紅外光譜圖。由圖可見，3 402 cm-1處的寬峰屬于-OH 或-NH 伸縮振動峰。其中，ZnO/PDA 和ZA 的吸收峰顯著強(qiáng)于ZnO，表明經(jīng)過PDA 改性后，其-OH 或-NH 含量顯著增大[18]。與ZnO 相比，ZnO/PDA中1 600 cm-1的吸收峰更強(qiáng)且在1 491 cm-1有吸收，1 600 和1 491 cm-1的信號峰分別歸屬于PDA 組分中吲哚（或吲哚結(jié)構(gòu)）的C==C 伸縮和N-H 彎曲振動[19-20]。400～ 550 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)峰屬于Zn-O 四面體鍵的特征吸收峰[21]，說明改性后ZnO 的結(jié)構(gòu)沒有改變。

圖1_b 為ZnO、ZnO/PDA 和ZA 的XRD 譜圖。由圖1_b 可見，ZnO 的衍射峰與六方纖鋅礦結(jié)構(gòu)相匹配（ICSD 參考代碼01-075-0576）。經(jīng)PDA 改性后，ZnO/PDA 未見新的衍射峰出現(xiàn)。而螯合銀以后，ZA 中出現(xiàn)了四個特征峰（2θ=38.081、44.421、64.401 和77.841），分別對應(yīng)于（111）、（200）、（220）和（311）晶面。以上四個特征峰與銀面心立方晶體數(shù)據(jù)庫（JCPDS 編號65-2871）吻合較好。XRD 結(jié)果表明，ZA 已成功合成。

圖1 ZnO、ZnO/PDA 和ZnO/Ag 納米復(fù)合粒子的紅外光譜和XRD 光譜Fig.1 FTIR spectraand XRD spectraof ZnO,ZnO/PDA and ZA

圖2 為ZnO、ZnO/PDA 和ZA 的TEM 照片與對應(yīng)的平均粒徑分布圖。由圖2_（a、d）可知，初始ZnO 大多為短棒狀，其平均粒徑為30.3 nm。經(jīng)多巴胺溶液進(jìn)行改性后，其平均粒徑增大到38.1 nm（圖2_b、圖2_e）。圖2_c 為ZA 的TEM 照片，其平均粒徑進(jìn)一步提高到49.4 nm（圖2_f）。

圖2 ZnO、ZnO/PDA 和ZnO/Ag 粒子的電鏡掃描圖和平均粒徑分布Fig.2 TEM images and statistical average sizes of ZnO,ZnO/PDA and ZA particles

2.2 Pickering 乳液穩(wěn)定性

滴入法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究所制備的乳液均能在水相中均勻分散，但不能分散在油中。因此，本研究中的乳液均為O/W 型。Pickering 乳液穩(wěn)定劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是乳液的穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。由圖3_（a-e）可見，隨著ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%增加到1.5%，乳液相體積逐漸增大；當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.5%以后，乳液相體積基本穩(wěn)定。圖3_f 進(jìn)一步顯示，當(dāng)ZA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%增加到1.5%時，乳液的平均直徑從（93.2±6.6）μm 迅速下降到（48.1±3.2）μm；當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)從1.5%增加到2.5%時，乳液平均直徑從（48±3.2）μm 緩慢下降到（34±3.6）μm。以上結(jié)果表明，當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)等于或小于1.5%時，ZA 主要被吸附到油-水界面，導(dǎo)致乳液液滴的直徑迅速下降；當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.5%后，部分ZA 將留在連續(xù)相中，導(dǎo)致乳液直徑的下降趨勢明顯減緩，這與文獻(xiàn)[22]現(xiàn)象相同。

圖3 不同ZnO/Ag 復(fù)合粒子質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的乳液（a-e）及其平均直徑（f）Fig.3 Emulsion droplet photos（a-e）and average diameters（f）with different ZA mass fractions

油相體積比是影響Pickering 乳液穩(wěn)定性的另一重要因素。由圖4_a 可見，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為10%時，乳液中大部分發(fā)生沉降。其原因可能是由于油滴表面完全被ZA 覆蓋后，導(dǎo)致油滴密度增大，油滴在重力作用發(fā)生的自然下沉。另一方面，大量的ZA 覆蓋油滴后，會導(dǎo)致ZA 顆粒的聚集效應(yīng)，從而發(fā)生沉降。由圖4_（a-c）可知，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)從10%增加到40%時，乳液相體積顯著增加。圖4_（d-e）發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步增加到50%和60%時，乳液相體積基本穩(wěn)定。圖4_f 進(jìn)一步顯示，當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)從10%增加到40%時，乳液液滴粒徑由（94.6±10.0）μm 減小到（47.3±4.0）μm。當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為60% 時，乳液液滴的粒徑最小，為（31.7±3.7）μm。

圖4 不同油相體積分?jǐn)?shù)下的乳液（a-e）和乳液直徑（f）Fig.4 Emulsion macrograph（a-e）and diameters（f）with different oil phase volume fractions

通過測定貯藏10 d 后乳液的乳析指數(shù)和傾倒圖進(jìn)一步評價所得乳液的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5。由圖5_a 可見，隨著ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳析指數(shù)持續(xù)下降當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)過1.5%后，其下降趨勢減緩。以上結(jié)果表明，隨著ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液的分層穩(wěn)定性提高。其原因可能是隨著ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其對乳液液滴的覆蓋度增加，顯著降低了表面能[23]。由圖5_c 可見，當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%時，乳液傾倒時具有明顯流動性，此時ZA 在油水界面形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)合界面比較脆弱。當(dāng)ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于或等于1.5%時，乳液傾倒時不具有明顯流動性，顯示此時網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已致密化，有利于乳液的長期穩(wěn)定貯藏。Feng 等[24]研究也表明隨著納米顆粒用量的增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得緊湊，穩(wěn)定性得到提高。

圖5_b 為儲存10 d 后乳析指數(shù)隨TTO 體積分?jǐn)?shù)的變化。隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加，乳析指數(shù)迅速下降。當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)大于30%時，乳析指數(shù)迅速下降。當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)為60%時，乳析指數(shù)達(dá)到最低值0%，乳液最穩(wěn)定。圖5_d 為乳液傾倒穩(wěn)定性隨TTO 體積分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律性。由圖5_d 可見，當(dāng)TTO 體積分?jǐn)?shù)為20%和30%時，乳液具有明顯的流動性。當(dāng)TTO 體積分?jǐn)?shù)大于或等于40%時，基本不顯示流動性，表明此時已形成了致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。以上研究結(jié)果與Zou 等[25]的研究結(jié)果基本一致。

圖5 不同ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同油相體積分?jǐn)?shù)的乳液儲存10 d 后乳析指數(shù)和傾倒顯示Fig.5 Eactitoid index and dumping chart of emulsions with different ZA mass fraction and different oil phase volume fraction after 10 d storage

綜上所述，當(dāng)穩(wěn)定劑ZA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，油相TTO 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時，可獲得具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的Pickering 乳液，并且該乳液可在25 ℃下穩(wěn)定貯藏10 d。

2.3 靜電紡絲纖維膜的制備

溶液黏度是影響分子鏈纏接及纖維成型的最重要參數(shù)[26]。由圖6 可見，當(dāng)紡絲液中PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%增加到10%時，紡絲液的動態(tài)黏度迅速從349 Pa?s 增加到1 850 Pa?s。由圖7 可見，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時所獲得的纖維基本呈串珠狀，表明低濃度PVA 時，紡絲液溶液的黏度低，溶液射流中的分子鏈之間纏結(jié)不夠，不能有效形成纖維。當(dāng)PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%后，可獲得均一連續(xù)的纖維，因此后期靜電紡絲研究使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的PVA 作為助紡劑。

圖6 聚乙烯醇濃度對紡絲液動態(tài)黏度的影響Fig.6 Effects of PVA concentration on dynamic viscosity of spinning solution

靜電紡絲過程中，電壓是另一個重要影響因素。電壓過小，則電場斥力小于表面張力，射流無法形成；電壓過大，泰勒錐會收縮到毛細(xì)管內(nèi)部，增加了射流的不穩(wěn)定性并導(dǎo)致所得纖維直徑粗細(xì)不 均[1]。圖7 為不同電壓下的所得PVA/HCS/ZA/TTO 纖維的光學(xué)顯微照片。由圖7 可見，當(dāng)接收距離一定（15 cm）時，PVA 質(zhì)量濃度為5%時，5 個電壓下成絲效果均不好，并有大量較大的液滴形成。當(dāng)PVA 質(zhì)量濃度提高到7.5%時，成絲效果明顯改善，可得到含有液滴的納米纖維。當(dāng)電壓從16 kV 提高到24 kV 時，液滴并沒有消失而且纖維直徑粗細(xì)不均的現(xiàn)象也未得到改善。當(dāng)PVA 質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高到10%時，可以得到較好的纖維。隨著電壓的增加，纖維的直徑逐漸減小。當(dāng)電壓為22 kV 和24 kV 時，所得納米纖維直徑較小且較均勻。但是，當(dāng)電壓為24 kV 時，射流存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象，并偶爾伴隨有乳液被電流擊穿的嘶嘶聲。綜合評價，當(dāng)接收距離為15 cm 時，22 kV為最優(yōu)電壓。本研究發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[27]結(jié)果相符。

圖7 電壓與聚乙烯醇濃度對PVA/HCS/ZA/TTO 纖維形貌的影響Fig.7 Effects of voltage and PVA concentration on PVA/HCS/ZA/TTO morphology

接收距離會影響纖維中溶劑的揮發(fā)，并進(jìn)一步影響纖維的形貌。由圖8 可知，當(dāng)電壓一定（22 kV）時，在接收距離為15 cm 時，相較于10 cm，纖維中串珠較少，這是因?yàn)殡妷阂欢ǎ邮站嚯x變大時，場強(qiáng)雖變?nèi)酰珖娚渚嚯x增大可充分拉伸和分化。但接收距離太近會導(dǎo)致拉伸不充分，溶劑不能完全揮發(fā)。

圖8 接收距離與聚乙烯醇濃度對PVA/HCS/ZA/TTO 纖維形貌的影響Fig.8 Effects of tip-to-collector distance and PVA concentration on PVA/HCS/ZA/TTO morphology

綜上所述，最優(yōu)的紡絲參數(shù)為電壓22 kV、接收距離15 cm、PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%。

為進(jìn)一步觀察所得納米纖維的微觀形貌，圖9采用SEM 和TEM 對比觀察不含TTO 的納米纖維（即PVA/HCS/ZA）、不含TTO 和ZA 的納米纖維（即PVA/HCS）及PVA/HCS/ZA/TTO 的微觀形貌。由圖9_(a～b)可知，PVA/HCS 和PVA/HCS/ZA 均為直徑均勻的納米級纖維，其平均直徑分別為0.22μm 和0.23 μm。此外，圖9_b 內(nèi)插入的TEM 圖表明，PVA/HCS/ZA 納米纖維中有較多的納米顆粒存在。由圖9_c 可見，負(fù)載TTO 后，纖維直徑顯著增大到0.60 μm，部分纖維存在黏連現(xiàn)象。圖9_c 內(nèi)插入的TEM 圖表明，負(fù)載TTO 的纖維存在黑色的內(nèi)層，具備典型的鉛筆芯結(jié)構(gòu)，屬于核/殼結(jié)構(gòu)的納米纖維。

圖9 三種納米纖維的掃描電鏡照片和直徑分布Fig.9 Scanning electronic microscopy (SEM) images and diameter distribution

TTO 主要由松油烯-4-醇和γ-松油烯組成[28]。由圖10_a 可見，PVA/HCS/ZA/TTO 纖維具有茶樹油的特征吸收峰2 919 cm-1（―CH3伸縮振動）和1 726 cm-1（C==C 伸縮振動）表明PVA/HCS/ZA/TTO 纖維已成功包埋了 TTO。圖 10_b 是PVA/HCS/ZA/TTO 纖維的EDS 光譜。由圖10_b 結(jié)果表明，PVA/HCS/ZA/TTO 纖維中Ag 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.12%。

圖10 PVA/HCS/ZA/TTO 納米纖維的紅外光譜和EDS 光譜Fig.10 Infrared and EDS spectra of PVA/HCS/ZA/TTO nanofibers

2.4 靜電紡絲纖維膜的特性研究

由圖11 可見，PVA/HCS、PVA/HCS/ZA 和PVA/HCS/ZA/TTO 三組納米纖維膜的水蒸氣透過量分別為（0.220±0.001）g/（cm2?d）、（0.210±0.002）g/（cm2?d）和（0.206±0.004）g/（cm2?d）。傷口愈合時會伴隨氧氣的吸收和二氧化碳的排出，因此，傷口敷料需，具備良好的透氣性能。據(jù)報道，正常的人體皮膚的水蒸氣的透過速率為0.024～0.192 g/（cm2?d），傷口敷料的最佳透氣范圍是0.20～0.25 g/（cm2?d）[29]。由于PVA/HCS/ZA/TTO納米纖維中有油相及固體顆粒存在，其纖維相對較粗，導(dǎo)致了納米纖維的緊密堆積和水蒸氣透過率的下降，但仍處于最佳透氣范圍內(nèi)。因此，PVA/HCS/ZA/TTO 符合傷口敷料的透氣性要求。

圖11 三種納米纖維的水蒸氣透過率Fig.11 Water vapor permeation of three kinds of nanofibers

為進(jìn)一步評價PVA/HCS/ZA/TTO 在傷口的應(yīng)用前景，圖12 中對比列出了PVA/HCS/ZA/TTO 與其他兩種纖維和納米粒子的抗菌性能。由圖12 可見，ZnO、ZnO/PDA、ZA 納米顆粒和載有ZA、TTO的復(fù)合納米纖維膜均具有良好的抗菌性。此外，由圖12 可明顯看出，ZnO 存在的樣品，其對金黃色葡萄球菌的抑制要明顯于大腸桿菌，與Norouzi等[30]描述相同。

圖12 納米顆粒和納米纖維抗菌活性Fig.12 Antibacterial activities of nanoparticles and nanofibers

如表1 所示，在納米顆粒中ZnO、ZnO/PDA和ZA 均顯示出抑菌性，且均為中敏抑菌效果，其中ZnO 的抗菌性能最好，這是因?yàn)橄鄬τ诟男訸nO表面PDA 的包覆，未改性ZnO 中Zn2+離子可以充分釋放，從而干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)，起到殺菌作用。紡絲液中，PVA/HCS 的紡絲液沒有抑菌效果，未載TTO 的PVA/HCS/ZA 紡絲液中由于含有ZA，故有中度敏感的抑菌性。而載TTO 的PVA/HCS/ZA/TTO復(fù)合纖維紡絲液，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具優(yōu)異的抑菌效果，尤其是對金黃色葡萄球菌可達(dá)到高度敏感。張品[31]以黏膠纖維為連續(xù)相，以β-環(huán)糊精/茶樹精油為分散相，制備了功能納米纖維，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌帶寬度僅為0.3 mm、0.2 mm。本研究制備的PVA/HCS/ZA/TTO納米纖維的抗菌性能良好，未來可嘗試開發(fā)為一種抗感染的傷口敷料。

3 結(jié)論

以自制的ZA 復(fù)合納米顆粒為Pickering 乳液乳化劑，當(dāng)乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、油相體積分?jǐn)?shù)為60%時可獲得穩(wěn)定的水包油乳液。靜電紡絲研究發(fā)現(xiàn)，工作電壓為22 kV、接收距離為15 cm 時，可獲得平均直徑為0.60 μm的具備核/殼結(jié)構(gòu)特征的納米纖維，實(shí)現(xiàn)HCS 和PVA 對TTO 的有效包埋。納米纖維的性能研究表明，其水蒸氣透過率在傷口輔料的最佳透氣范圍內(nèi)，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能良好。