菊黃東方鲀精巢醇提物（AETT）的抗疲勞作用與毒理安全性

劉淑集，廖登遠(yuǎn)，李水根，蘇永昌，蘇 捷，劉智禹

（1.福建省水產(chǎn)研究所//國(guó)家海水魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心（廈門(mén)）//福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén)，361013；2.福建海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)校，福建 福州，350000）

疲勞是現(xiàn)代社會(huì)一種常見(jiàn)的亞健康狀態(tài)，長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài)，會(huì)使機(jī)體發(fā)生內(nèi)分泌紊亂，抵抗力和免疫力逐漸下降，引起早衰，甚至?xí)l(fā)一些潛在的慢性疾病急性發(fā)作，出現(xiàn)器質(zhì)性病變[1-2]。因此，緩解疲勞，改善人體亞健康狀態(tài)受到人們?cè)絹?lái)越多的重視，研究開(kāi)發(fā)具有抗疲勞功能食品或營(yíng)養(yǎng)食品極具市場(chǎng)前景。如蔡亞偉等[3]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣（Ostrea gigas）肉提取物可以提高小鼠的抗疲勞能力和耐缺氧能力，增強(qiáng)小鼠的免疫力；劉嫻[4]制備的青石斑（Chromileptes altivelis）魚(yú)肉多肽能降低小鼠血清尿素氮的含量，提高小鼠肝糖原含量，具有較好的抗疲勞作用；董陳潁等[5]研究的鮭（Salmo sala）蛋白（肽）能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，降低血清尿素氮含量，具有明顯的抗疲勞作用。

河鲀是一種高蛋白、低脂肪的魚(yú)類(lèi)，其精巢具有養(yǎng)精固氣、滋陰補(bǔ)陽(yáng)的功效[6]，在日本民間有用河鲀精巢泡酒飲用的風(fēng)俗。但河鲀精巢泡酒發(fā)揮保健功效的成分及其是否有毒性等至今均未有研究報(bào)道。菊黃東方鲀（Takifugu flavidus）屬于鲀科東方屬，屬于溫帶近海底層魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)福建省養(yǎng)殖的主要河鲀品種之一。養(yǎng)殖的菊黃東方鲀的魚(yú)肉、魚(yú)皮、魚(yú)骨、精巢均是無(wú)毒的，河豚毒素的測(cè)定結(jié)果低于限值，屬于D 級(jí)（無(wú)毒）[7]。因此，本研究以食用酒精浸泡菊黃東方鲀精巢制備的醇提物［alcohol extract of testis from T.flavidus（AETT）］為原料，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間和血清尿素氮、血清乳酸、肝糖原含量的變化，研究其抗疲勞功效及毒理安全性，以期為河鲀精巢抗疲勞保健酒開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小白鼠（北京華阜康生物科技有限公司，無(wú)特定病原體SPF 級(jí)別）；菊黃東方鲀精巢（福建省漳州市漳浦縣佛曇鎮(zhèn)）；乳酸、肝糖原、血清尿素氮等試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；?；撬幔ò⒗≡噭┯邢薰荆?；生理鹽水（國(guó)藥集團(tuán)），香菇多糖（遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）

1.2 儀器

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（TECAN 集團(tuán)有限公司）；離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)CHRIST）

1.3 方法

1.3.1菊黃東方鲀精巢醇提物的制備 將菊黃東方鲀進(jìn)行剖殺，收集精巢組織，清水洗凈，凍干，粉碎保存。用52 °食用酒精，按照料液質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶25、水浴溫度50 ℃的條件提取4.5 h，離心，取上清液，減壓蒸餾濃縮，冷凍干燥得到菊黃東方鲀精巢醇提物（得率約為24.2%）。

1.3.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1動(dòng)物分組 取60 只小鼠，體質(zhì)量為（20±2）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。將小鼠隨機(jī)分為6 組，包括菊黃東方鲀精巢醇提物飼喂低、中、高劑量組［50、100、200 mg/（kg?d）］、精巢原樣組［100 mg/(kg?d)］、陽(yáng)性對(duì)照組［香菇多糖50 mg/（kg?d）］和空白對(duì)照組（生理鹽水），每組10 只小鼠，雌雄各半；分組后25 ℃適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d，光暗12 h∶12 h 交替；每天灌胃1 次，灌胃劑量見(jiàn)分組。灌胃前小鼠稱(chēng)重記錄，連續(xù)28 d。此實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食及飲水。

1.3.2.2負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 末次給藥30 min 后，將各組小鼠取出，尾部綁定該只小鼠體質(zhì)量5%的自制負(fù)重物；在游泳箱中放入適量水，水深約40 cm，水溫保持（25±1）℃；將要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的小鼠充分打濕毛發(fā)，防止毛發(fā)間的空氣對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響；將小鼠放入游泳箱游泳。每只水箱一次放入5 只小鼠。如有小鼠趴在游泳箱邊緣部位休息，則用玻璃棒驅(qū)離，使其保持運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，記錄小鼠從游泳開(kāi)始至力竭的時(shí)間（以小鼠身體完全沒(méi)入水中且持續(xù)10 s 后為判斷標(biāo)準(zhǔn)），為小鼠力竭游泳時(shí)間。

1.3.2.3血清尿素氮和肝糖原含量的測(cè)定 末次給藥30 min 后，將小鼠毛發(fā)充分打濕，置于游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，取出，擦拭掉水，讓小鼠休息60 min；小鼠摘取眼球取血，常溫放置2 h 后，1 575 g 離心10 min 分離血清；解剖小鼠，分離得到小鼠肝臟，生理鹽水漂洗后，吸干水分，精確稱(chēng)量100 mg，利用尿素氮和肝糖原試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清尿素氮和肝糖原的含量。

1.3.2.4血乳酸含量測(cè)定 末次給藥30 min 后，將各組小鼠取出，尾靜脈采血20 μL；在游泳箱中保持25 ℃水溫，不負(fù)重游泳10 min，尾靜脈取血20 μL；小鼠休息20 min 后，再次尾靜脈取血20 μL；利用全血乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)3 次血中乳酸的含量，計(jì)算全血乳酸曲線下面積。公式為：全血乳酸曲線下面積=5 ×（游泳前血乳酸值+3 ×游泳后0 min 血乳酸值+2 × 游泳后休息20 min 的血乳酸值）。

1.3.2.5毒理實(shí)驗(yàn) 采取 GB 15193.3-2014[8]和Zhao 等[9]的方法進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)雌雄小鼠各10 只，級(jí)別為ICR 級(jí)別，分開(kāi)飼養(yǎng)。適應(yīng)一周后，小鼠禁食6 h，但飲水不受限制。之后將菊黃東方鲀精巢醇提物按劑量15 g/kg 給小鼠灌胃。小鼠灌胃完成后，觀察其狀態(tài)，一共觀察14 d，并解剖小鼠，觀察小鼠內(nèi)臟[10]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間進(jìn)行多重比較，LSD 和Duncan’s multiple range test 判斷組間樣本的顯著差異；每組小鼠10只，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，取平均值，表示為

2 結(jié)果與分析

2.1 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由表1 可以看出，空白組、菊黃東方鲀精巢醇提物高、中、低劑量劑量組、原樣組和陽(yáng)性組小鼠的體質(zhì)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)。灌胃飼養(yǎng)相同時(shí)間時(shí)，空白組、菊黃東方鲀精巢醇提物低、中、高劑量組、原樣組和陽(yáng)性組，各組組間小鼠體質(zhì)量的差異不顯著（P >0.05），說(shuō)明菊黃東方鲀精巢醇提物飼喂對(duì)小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有顯著影響（P >0.05）。

表1 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effects of AETT on weight of mice g

2.2 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

灌胃菊黃東方鲀精巢醇提物飼養(yǎng)28 d 后，各組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間如圖1 所示。高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為45.35 min，是空白對(duì)照組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的2.24 倍，極顯著地延長(zhǎng)了小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間（P <0.01），提示灌胃高劑量AETT 使小鼠體力明顯增加；中、低劑量組和原樣組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間分別是空白組的1.41、1.09 倍和1.23 倍，在一定程度上延長(zhǎng)了小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，與空白組無(wú)顯著差異（P >0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明菊黃東方鲀精巢醇提物能夠延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

圖1 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Fig.1 Effects of AETT on weight-bearing swimming time in mice

2.3 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠血清乳酸含量的影響

如圖2 所示，喂養(yǎng)28 d 后，各組小鼠無(wú)負(fù)重游泳1 h 后，高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的血乳酸含量分別比空白組減少了20.0%、12.4%和19.6%，具有顯著差異（P＜0.05），低劑量組和原樣組的血乳酸含量與空白組的血乳酸含量相近。說(shuō)明經(jīng)過(guò)酒精浸提的菊黃東方鲀精巢產(chǎn)物可以有效地清除或延緩小鼠體內(nèi)乳酸堆積，隨著劑量的增加，對(duì)血乳酸的清除作用逐漸明顯，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖2 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠血清乳酸含量的影響Fig.2 Effect of AETT on serum lactic acid content in mice

2.4 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響

各組小鼠喂養(yǎng)28 d 后，血清尿素氮變化情況如圖3 所示。高、中、低劑量組、陽(yáng)性組和原樣組分別比空白組降低了37.30%、22.0%、13.7%、25.4%和10.1%，高劑量組血清尿素氮含量與空白組比具有極顯著差異（P＜0.01），低劑量組和原樣組則差異不明顯。菊黃東方鲀精巢經(jīng)醇提取后，在一定劑量范圍內(nèi)，不同劑量組給藥，能夠減輕血清中尿素氮的含量，且隨著劑量增加，作用越顯著，提示菊黃東方鲀精巢醇提物可以提高腎臟清除尿素氮的能力，具有一定的抗疲勞功效。

圖3 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠血清尿素氮的影響Fig.3 Effect of AETT on serum urea nitrogen content in mice

2.5 菊黃東方鲀精巢醇提物急性毒理實(shí)驗(yàn)

以15 g/kg 劑量給小鼠灌胃菊黃東方鲀精巢醇提物，并持續(xù)觀察14 d，結(jié)果見(jiàn)表2。小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象，體質(zhì)量變化正常。小鼠的攝食、毛色、大小便、精神狀態(tài)等行為活動(dòng)均未發(fā)現(xiàn)異常。小鼠眼、鼻腔、口腔未發(fā)現(xiàn)分泌異常物質(zhì)。觀察后將小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察內(nèi)臟器官未見(jiàn)異常。該結(jié)果表明菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠無(wú)毒。

表2 菊黃東方鲀精巢醇提物急性毒性試驗(yàn)觀察記錄Table 2 Observation records of AETT in acute toxicity test

圖4 菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠肝糖原含量的影響Fig.4 Effect of AETT on hepatic glycogen content in mice

3 討論

疲勞是一種復(fù)雜的生理生化過(guò)程，機(jī)體的生理過(guò)程會(huì)因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)耐力下降不能維持一定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。因此，常常采用負(fù)重游泳試驗(yàn)考察小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力反映機(jī)體抗疲勞能力的大小[5]。機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中首先會(huì)消耗體內(nèi)的肌酸磷酸（CP）和三磷酸苷（ATP），分解糖原變成苯丙酸，最后變成乳酸，在此期間還會(huì)產(chǎn)生ATP，其又可作為能源[11]。而在較長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)后，當(dāng)機(jī)體可利用的糖原耗竭時(shí)，機(jī)體不能通過(guò)糖、脂肪代謝獲得能量時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸就會(huì)進(jìn)入分解代謝[4]，同時(shí)核苷酸的分解代謝也會(huì)加強(qiáng)，導(dǎo)致脫氨基生成氨[10]，致使血清中尿素氮含量迅速增加，使得機(jī)體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)能力變差，肌體就顯示出疲勞的現(xiàn)象[12-13]。大量運(yùn)動(dòng)也會(huì)使骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的主要代謝失去平衡，使機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，也加快糖酵解速度，導(dǎo)致大量的乳酸產(chǎn)生，引起疲勞[10]。運(yùn)動(dòng)耐力下降引起運(yùn)動(dòng)性疲勞，負(fù)重游泳時(shí)間的長(zhǎng)短是運(yùn)動(dòng)耐力的直接體現(xiàn)[14-15]，也可反映抗疲勞的能力。本研究結(jié)果顯示，菊黃東方鲀精巢醇提物可增加小鼠力竭游泳時(shí)間；Yang等[16]研究表明黑豆籽醇提物能夠延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，具有抗疲勞潛力。

糖與耐力運(yùn)動(dòng)的關(guān)系非常密切，糖原均會(huì)迅速分解產(chǎn)生ATP，維持機(jī)體血糖平衡。運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉會(huì)消耗肌糖原，引起血糖降低，工作能力下降，誘發(fā)疲勞[17-18]。因此，糖原含量高低是機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐受力的重要標(biāo)志，可用于測(cè)定疲勞程度[19-21]。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體相對(duì)缺氧，使有氧肌肉活動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧代謝，糖酵解加快，乳酸大量堆積，使肌肉中H+濃度升高，pH 值下降，引起機(jī)體延遲性酸痛，產(chǎn)生疲勞感覺(jué)。因此，血乳酸水平可以反映有氧代謝能力、疲勞的產(chǎn)生和消除速度，也是評(píng)價(jià)機(jī)體有氧代謝能力和疲勞程度的敏感指標(biāo)[22-23]。尿素氮是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物。當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)使正常的能量代謝平衡遭到破壞后，并且隨著機(jī)體運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)性降低及蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝作用加強(qiáng)，血清尿素氮增加就越明顯[24-25]。血清尿素氮含量的變化也是評(píng)價(jià)抗疲勞效果的重要指標(biāo)。當(dāng)菊黃東方鲀精巢醇提物被吸收進(jìn)入體內(nèi)有助于肌糖原的積累，增加肝糖原的儲(chǔ)備量，減少血乳酸和血清尿素氮的產(chǎn)生量，說(shuō)明菊黃東方鲀精巢醇提物具有增加機(jī)體糖原儲(chǔ)備，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷耐受能力的功效。這與王勇剛等[12]研究的魚(yú)精多肽在抗疲勞方面的作用結(jié)果相吻合。Hu 等[26]也證實(shí)核桃分心木（Diaphragma juglandis）的醇提物能夠延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，減少血清尿素氮含量，提高乳酸脫氫酶水平和肝糖原含量，具有抗疲勞和抗氧化功效。對(duì)于菊黃東方鲀精巢醇提物的使用劑量來(lái)說(shuō)，呈現(xiàn)劑量效正相關(guān)趨勢(shì)，隨著劑量增加，藥效也跟著明顯。

根據(jù)抗疲勞保健食品的功能評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法，若1 項(xiàng)以上（含1 項(xiàng)）運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和2 項(xiàng)以上（含2 項(xiàng)）生化指標(biāo)為陽(yáng)性，即可判斷該受試物具有抗疲勞作用[21]。菊黃東方鲀精巢醇提物動(dòng)物試驗(yàn)中，1 項(xiàng)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)和3 項(xiàng)生化指標(biāo)的結(jié)果為陽(yáng)性，可以判斷其具有抗疲勞效果。經(jīng)過(guò)急性毒理實(shí)驗(yàn)確認(rèn)菊黃東方鲀精巢醇提物對(duì)小鼠無(wú)毒副作用，是安全的。因此，采用河豚魚(yú)精巢泡酒開(kāi)發(fā)保健酒具有抗疲勞功效，具有高值化開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。