南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤抑制作用機(jī)制研究

蔡 偉，余陳歡，羅益遠(yuǎn) ，劉 姝

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 中藥學(xué)院，浙江 寧波 315500； 2.杭州醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310053）

南方紅豆杉Taxus chinensis（Pilg.）Rehd. var.mairei（Lemee et Levl.）Cheng et L. K.Fu是目前我國(guó)常用中藥材，味辛、甘，性大溫，歸胃、肝經(jīng)，具有解毒、散結(jié)、止痛等功效，臨床上用于治療肺癌、乳腺癌、宮頸癌等，現(xiàn)代研究表明其有效成分主要為紫杉醇等紫杉烷類成分以及黃酮、多糖類等成分[1]。紫杉醇抗腫瘤作用時(shí)常常產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，且易產(chǎn)生耐藥性，限制了其在臨床上的使用[2]。隨著抗腫瘤中藥的深入研究，部分中藥及其活性成分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有良好的增效減毒作用[3-5]。

本課程組前期研究了南方紅豆杉中總黃酮、總多糖及其與紫杉醇配伍對(duì)4T1、A549、MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響以及對(duì)荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制情況，發(fā)現(xiàn)總多糖能夠增強(qiáng)紫杉醇體外對(duì)4T1、A549、MCF-7細(xì)胞以及體內(nèi)對(duì)S180荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用，體內(nèi)總多糖減輕紫杉醇抗腫瘤時(shí)的骨髓抑制毒副作用[6]。結(jié)果表明紫杉醇可以通過配伍南方紅豆杉總多糖達(dá)到增效減毒作用，但該作用的具體機(jī)制尚不明確。

因此，本研究通過建立S180小鼠荷瘤模型，采用HE染色、TUNEL染色、免疫組化、Western blot等方法對(duì)南方紅豆杉總多糖與紫杉醇聯(lián)用抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步高效、綜合利用南方紅豆杉資源提供研究思路，并且為減少紫杉醇臨床用量、耐藥性等提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；TM 3型石蠟包埋機(jī)（英國(guó)Shandon Histocentre公司）；BX20型熒光顯微鏡攝像機(jī)（日本奧林巴斯公司）；TGL-16G型低溫高速離心機(jī)（上海飛鴿公司）；165-1801型電泳槽（美國(guó)伯樂公司）；WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀（ATTO CORPORATION）；YT-613型拷片機(jī)（湖北省孝感亞光運(yùn)用電子技術(shù)研究所）；DSHZ-300型多用途水浴恒溫震蕩器（江蘇太倉實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LD-UPWF型純水儀（美國(guó)密理博公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)上海精宏醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.1.2材料與試劑 紫杉醇（臨用前生理鹽水稀釋，HPLC ≥ 98%，上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：124977-28-5）；過硫酸銨、丙烯酰胺、中性樹膠（西格瑪公司）；考馬斯亮藍(lán)G250和R250（上海研域試劑有限公司，批號(hào)：140306）；蛋白酶K（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：140306）；石蠟（浙江東騰蠟業(yè)有限公司）；二甲苯（分析純）（嘉興市中昊化工有限公司）；麗春紅（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限）；PVDF膜（上海麗臣生物科技有限公司）；Trizol（美國(guó)英杰生命技術(shù)公司）。

山羊抗小鼠二抗（HRP標(biāo)記）購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；免疫組化檢測(cè)EnVisionTM試劑盒購自丹麥DAKO公司；β-catenin抗體（BA0426）、CDK4抗 體（BA0310） 、Survivin抗 體（BA1420）購自武漢博士德生物技術(shù)有限公；Cyclin-Dl抗體（sc-8396）、Bcl-2抗體（sc-492）、Bax抗體（sc-526）購自美國(guó)Santacruz公司。

1.1.3藥材 南方紅豆杉采自浙江省寧海縣雙峰鄉(xiāng)種植基地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)俞冰副教授鑒定為正品南方紅豆杉Taxus chinensis（Pilg.）Rehd. var.mairei（Lemee et Levl.）Cheng et L. K.Fu，總多糖由浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)室提取分離，純度 > 50%[6]。

1.1.4動(dòng)物、瘤株 鼠肉瘤S180腫瘤細(xì)胞由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子醫(yī)學(xué)中心提供；ICR小鼠，40只，雌雄各半，體質(zhì)量為（20 ± 3）g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2014-0033，使用許可證：SYXK（浙）2014-0113。

1.2 方法

1.2.1分組、造模與給藥 將凍存的鼠肉瘤S180腫瘤細(xì)胞懸液接種到ICR小鼠腹腔內(nèi)傳代，無菌條件下抽取腹水，冰浴條件下滅菌生理鹽水稀釋，混勻制成1×106個(gè)/mL腫瘤細(xì)胞混懸液（鏡下計(jì)數(shù)）。取ICR小鼠40只，雌雄各半，按混交均勻表隨機(jī)分為4組，每組10只。將S180腫瘤細(xì)胞混懸液按每只0.2 mL接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下。3組給藥組分別按紫杉醇0.025 mg/g、紅豆杉多糖1.332 mg/g、紫杉醇0.025 mg/g +紅豆杉多糖1.332 mg/g進(jìn)行分組灌胃給藥，另1組給予生理鹽水，作為模型對(duì)照組，接瘤后連續(xù)給藥7 d，停藥后第2天，將腫瘤塊完整剝下[6]，稱量離體瘤塊重量，計(jì)算各組抑瘤率：抑瘤率（%） =[（模型組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/模型組平均瘤重] × 100%。

1.2.2HE染色腫瘤組織病理檢測(cè) 上述腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋切片（厚度：4 μm），HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織病理特征。

1.2.3TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡 上述腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚度：4 μm），TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞核呈棕色或黃色顆粒狀；陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色，無棕色顆粒。每張切片在顯微鏡200倍視野下，計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，換算成凋亡標(biāo)記指數(shù)。凋亡指數(shù)（%） =（視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)）×100%，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4免疫組化染色法檢測(cè)腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-Dl、CDK4、Bcl-2、Bax以 及Survivin蛋白的表達(dá) 上述腫瘤組織在中性緩沖福爾馬林（pH = 7.4）固定12 h后取材脫水、石蠟包埋、切片，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。鏡下觀察結(jié)果：在細(xì)胞漿和/或核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細(xì)胞。

β-catenin、Bcl-2、Bax和Survivin染色結(jié)果陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于移植瘤的腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)，少量在移植瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞。Cyclin-Dl陽性表達(dá)在移植瘤的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，CDK4陽性表達(dá)主要于移植瘤的腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)。

陽性計(jì)數(shù)如下：每張切片在200倍視野下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)，換算成陽性率：陽性率（%）=（視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)）×100%，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5Western blot檢測(cè)分析Bcl-2、Bax和Survivin蛋白水平 在采用免疫組化染色初步定性Bcl-2、Bax、Survivin蛋白表達(dá)后，進(jìn)一步采用Western blot對(duì)Bcl-2、Bax、Survivin蛋白進(jìn)行定性和定量檢測(cè)分析。取出冷凍保存的腫瘤組織，按Western blot檢測(cè)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)X光片上的蛋白帶進(jìn)行掃描和半定量分析。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤重及抑瘤率結(jié)果

聯(lián)合用藥組對(duì)比模型組、紫杉醇組及多糖組，瘤重減少，腫瘤抑制率增加（P< 0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組瘤重及抑瘤率（±s, n = 10）Tab. 1 Tumor weight and tumor inhibition rate in each group （±s, n = 10）

表1 各組瘤重及抑瘤率（±s, n = 10）Tab. 1 Tumor weight and tumor inhibition rate in each group （±s, n = 10）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 瘤重/mg 抑瘤率/%模型對(duì)照組 1.22 ± 0.14 -紫杉醇組 0.87 ± 0.16* 28.69 ± 1.64*多糖組 0.91 ± 0.14 25.41 ± 0.00*聯(lián)合用藥組 0.58 ± 0.08*#& 52.46 ± 4.92*#&F 38.52 685.10 P 0.000 0.000

2.2 腫瘤組織病理HE染色結(jié)果

腫瘤組織的HE染色結(jié)果顯示（見圖1），模型組腫瘤組織表現(xiàn)出典型的腫瘤病理特征，即腫瘤細(xì)胞豐富、密集，細(xì)胞核大、不規(guī)則，細(xì)胞漿少等。與模型組相比，用藥后腫瘤細(xì)胞數(shù)減少，核皺縮，其中多糖組、紫杉醇組視野范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)減少較多，并出現(xiàn)較大的間隙；聯(lián)合用藥組相比紫杉醇組、多糖組，腫瘤細(xì)胞數(shù)目更少，形成的間隙更大。

圖1 S180小鼠腫瘤組織HE染色照（±s, n = 3, × 200）Fig.1 HE staining photograph of tumor tissue in S180 mice（±s, n = 3, × 200）

2.3 腫瘤組織細(xì)胞凋亡結(jié)果

腫瘤組織TUNEL染色結(jié)果（見圖2），模型組幾乎全是細(xì)胞核被蘇木素染為藍(lán)色的活細(xì)胞，僅見少數(shù)幾個(gè)棕色凋亡細(xì)胞，紫杉醇組、多糖組、聯(lián)合用藥組棕色凋亡細(xì)胞數(shù)量多于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

圖2 各組對(duì)S180小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響（±s, n = 3, × 200）Fig.2 Effect of each group on apoptosis of tumor tissue in S180 mice（±s, n = 3, × 200）

2.4 免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)β-catenin、Cyclin-Dl、CDK4、Bcl-2、Bax以 及Survivin蛋 白表達(dá)水平

給藥后，聯(lián)合用藥組相比模型組、紫杉醇組、多糖組腫瘤組織內(nèi)β-catenin、Cyclin-Dl、Survivin蛋白表達(dá)減少（P< 0.05）；CDK4、Bcl-2蛋白給藥后，聯(lián)合用藥組相比模型組、多糖組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。同時(shí)腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白，聯(lián)合用藥組相比模型組、多糖組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），結(jié)果見表2、圖3。

表2 各組S180小鼠腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-D1、CDK4、Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)（±s, n = 3）Tab. 2 The expression of β-catenin, Cyclin-D1, CDK4, Bcl-2 , Bax and Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

表2 各組S180小鼠腫瘤組織中β-catenin、Cyclin-D1、CDK4、Bcl-2、Bax、Survivin蛋白的表達(dá)（±s, n = 3）Tab. 2 The expression of β-catenin, Cyclin-D1, CDK4, Bcl-2 , Bax and Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 β-catenin Cyclin-D1 CDK4 Bcl-2 Bax Survivin模型組 94.4 ± 11.3 84.5 ± 8.1 81.1 ± 9.3 87.5 ± 9.9 57.3 ± 5.4 90.4 ± 8.2紫杉醇組 15.2 ± 1.2* 42.5 ± 4.1* 63.2 ± 5.8* 22.6 ± 3.3* 79.0 ± 8.5* 81.8 ± 6.5多糖組 33.5 ± 2.2*# 75.2 ± 6.2# 72.9 ± 8.2 91.1 ± 8.4# 51.7 ± 6.2# 72.4 ± 3.2*聯(lián)合用藥組 9.7 ± 0.8*#& 28.8 ± 3.6*#& 54.4 ± 6.3*& 19.3 ± 2.2*& 77.2 ± 8.1*& 56.3 ± 5.3*#&F 447.90 208.30 27.30 338.80 37.27 57.70 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Survivin蛋白表達(dá)水平

由表3、圖4可知，聯(lián)合用藥組相比模型組、紫杉醇組、多糖組腫瘤組織內(nèi)Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)水平減少，同時(shí)Bax、Bax/Bcl-2比值增大，與免疫組化觀察結(jié)果基本一致，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

圖4 各組S180小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2、Survivin電泳條帶 （±s, n = 3）Fig.4 Electrophoresis of Bax, Bcl-2 and Survivin in tumor tissue of S180 mice in each group（±s, n = 3）

表3 S180腫瘤組織中Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)相對(duì)水平 （±s, n = 3）Tab. 3 The relative expression of Bax, Bcl-2, Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

表3 S180腫瘤組織中Bax、Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)相對(duì)水平 （±s, n = 3）Tab. 3 The relative expression of Bax, Bcl-2, Survivin protein in S180 mice tumor tissue（±s, n = 3）

注：與模型組比較，*P < 0.05；與紫杉醇組比較，#P < 0.05；與多糖組比較，&P < 0.05

組別 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Survivin模型組 0.29 ± 0.04 0.47 ± 0.06 0.65 ± 0.07 1.09 ± 0.11紫杉醇組 0.58 ± 0.07* 0.35 ± 0.01* 1.89 ± 0.22* 0.58 ± 0.06*多糖組 0.36 ± 0.03*# 0.44 ± 0.03# 0.80 ± 0.07*# 0.72 ± 0.07*聯(lián)合用藥組 0.91 ± 0.11*#& 0.29 ± 0.03*#& 3.29 ± 0.36*#& 0.42 ± 0.06*#&F 79.76 24.82 158.70 67.57 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

目前大多數(shù)抗癌藥機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤增殖，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路調(diào)控異常是造成腫瘤耐藥現(xiàn)象的主要原因之一。凋亡信號(hào)通路主要有死亡受體介導(dǎo)途徑和線粒體凋亡途徑[7]，線粒體凋亡途徑一個(gè)重要步驟是線粒體膜電位下降引起線粒體膜一系列生化改變。Bcl-2家族蛋白主要作用位點(diǎn)在線粒體膜上，分為Bax、Bak等促凋亡蛋白以及Bcl-2等抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡發(fā)生中，Bax/Bcl-2比值是比單純抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白改變更為關(guān)鍵的指標(biāo)之一，比值升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。本研究結(jié)果觀察到紅豆杉總多糖與紫杉醇及其配伍給藥后，抗凋亡蛋白Bcl-2的數(shù)量明顯下降，而促凋亡蛋白Bax數(shù)量明顯上升，Bax/Bcl-2比值明顯升高（P<0.05）。提示南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇促S180荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡作用與凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2家族相關(guān)，可能是通過線粒體途徑產(chǎn)生作用。

Cyclin-D1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，比其它Cyclin蛋白更敏感的一個(gè)指標(biāo)，被公認(rèn)為原癌基因[9-10]，Cyclin通過結(jié)合并激活CDK4，經(jīng)一系列反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。Wnt/β-catenin （β-連環(huán)蛋白）通路是調(diào)控細(xì)胞周期的重要通路，正常成熟細(xì)胞中沒有Wnt信號(hào)，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)被降解。胞漿內(nèi)β-catenin增多，是腫瘤發(fā)生過程的關(guān)鍵事件之一[12]。其大致關(guān)系是Wnt信號(hào)通路中β-catenin水平增加，激活Cyclin-D1基因表達(dá)，Cyclin-D1水平升高，激活CDKs，經(jīng)一系列反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞增殖導(dǎo)致腫瘤[13-14]。基于此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中β-catenin表達(dá)水平，并觀察其下游靶蛋白Cyclin-Dl的表達(dá)以及被Cyclin-Dl特異性激活的CDK4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，初步認(rèn)為南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇影響腫瘤細(xì)胞周期的機(jī)制可能是通過對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路負(fù)調(diào)控產(chǎn)生抗腫瘤作用。

Survivin蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，在幾乎所有腫瘤中均有分布，不僅具有抗凋亡作用，還有促增殖作用[15-17]。Survivin抑制細(xì)胞凋亡時(shí)，Cyclin-Dl同時(shí)過度表達(dá)，兩者協(xié)同作用使細(xì)胞增殖失控，Survivin與Cyclin-D1存在正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到相比模型組、紫杉醇組，聯(lián)合用藥后Survivin與Cyclin-D1蛋白表達(dá)均下降（P< 0.05）。

4 結(jié)論

南方紅豆杉總多糖增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)S180荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生凋亡效應(yīng)，該效應(yīng)可能是通過線粒體途徑等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路負(fù)調(diào)控作用等抑制細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)，然機(jī)體凋亡機(jī)制復(fù)雜，其明確的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。