高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定煙草及其制品中3種鉛形態(tài)

吳若昕，田志章，張春濤，田楠，邢立霞，李登科，馬立超

(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心 天津工作站,天津 300163)

鉛是一種在自然界中廣泛分布的重金屬元素[1],在土壤、環(huán)境及生物樣品中均有檢出,且以不同形態(tài)存在,如煙草作物中的鉛[2-3]。目前針對鉛的分析多限于鉛總量的測定,而不同化學(xué)形態(tài)鉛的毒性差異顯著,如有機(jī)鉛的毒性遠(yuǎn)大于無機(jī)鉛,不同有機(jī)鉛毒性也不盡相同[4-6]。中國是煙草生產(chǎn)和使用大國,故對煙草中鉛形態(tài)進(jìn)行分析成為維護(hù)消費(fèi)者健康的當(dāng)務(wù)之急[7]。

鉛形態(tài)分析多采用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、超臨界流體色譜法(SFC)等分離技術(shù)與原子吸收光譜法(AAS)、原子發(fā)射光譜法(AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[8-11]等痕量金屬檢測技術(shù)聯(lián)用的方法。GC 是最常用的分離方法[12],雖然其分離效率較高,但樣品前處理復(fù)雜(涉及多步凈化和衍生化操作),測定結(jié)果不穩(wěn)定。HPLC能夠在常溫下有效分離性質(zhì)相近的成分,更適合分離難揮發(fā)且熱穩(wěn)定性差的烷基鉛[13]。在常見的與HPLC聯(lián)用的檢測器中,ICP-MS憑借其高靈敏度、寬線性范圍、可進(jìn)行多元素/同位素同時(shí)測定等優(yōu)勢,成為元素形態(tài)分析的首選[14]。二者結(jié)合可實(shí)現(xiàn)待測元素的亞μg·L－1水平含量測定[15]。在HPLC分析中,常采用含乙二胺四乙酸(EDTA)或其二鈉鹽的乙酸鈉溶液作流動(dòng)相中的水相。如文獻(xiàn)[14]選擇以乙二胺四乙酸二鈉-乙酸鈉溶液和甲醇作為流動(dòng)相,實(shí)現(xiàn)了無機(jī)鉛[Pb(Ⅱ)]、三甲基鉛(TML)和三乙基鉛(TEL)的分離,并對水產(chǎn)品中的不同形態(tài)鉛含量進(jìn)行了測定。文獻(xiàn)[16]以乙酸鈉-乙酸緩沖溶液為水相(以EDTA 作為螯合劑),測定大米、豬肉、鱈魚等食品中鉛形態(tài)含量。然而采用以上流動(dòng)相時(shí),不同鉛形態(tài)分離度較差且色譜峰峰形不對稱,難以滿足微量和痕量元素的精確定量。ICP-MS在煙草行業(yè)的元素分析中的應(yīng)用常見于單一元素總量的測定[17],鮮少有元素形態(tài)分析的報(bào)道。本工作通過對樣品前處理、色譜條件、質(zhì)譜條件的系統(tǒng)性優(yōu)化,建立了HPLC-ICP-MS測定煙草中鉛形態(tài)含量的方法,旨在為煙草等復(fù)雜基質(zhì)中元素形態(tài)分析的方法的開發(fā)及元素的形態(tài)分布規(guī)律研究提供有益參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260-7700x型高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀;Milli-Q 型超純水儀;MARS型微波消解儀;Z300型高速離心機(jī);0.22μm 聚醚砜濾膜。

Pb(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 mg·L－1。

有機(jī)鉛混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg·L－1,取適量有機(jī)鉛標(biāo)準(zhǔn)品三甲基氯化鉛、三乙基氯化鉛,用2%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液溶解并稀釋配制成1 000 mg·L－1的有機(jī)鉛混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,置于4 ℃避光保存,備用。

不同鉛形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液均由以上2種鉛標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用流動(dòng)相逐級稀釋制得,現(xiàn)配現(xiàn)用。

冰乙酸、甲醇為色譜純;1-戊烷磺酸鈉為優(yōu)級純;30%過氧化氫溶液、硝酸為超純試劑;三甲基氯化鉛和三乙基氯化鉛標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為99.99%;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HPLC條件

ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱(100 mm×4.6 mm,3.5μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積50μL;流量1.0 mL·min－1;流動(dòng)相為體積比為60∶40的1 mmol·L－11-戊烷磺酸鈉溶液和甲醇的混合溶液(pH 4.5);洗脫方式為等度洗脫。

1.2.2 ICP-MS條件

ICP-MS 和 HPLC 的連接管為聚醚醚酮(PEEK)管;射頻功率1 550 W;射頻電壓1.80 V;霧化室溫度－5 ℃;冷卻氣流量15 L·min－1,輔助氣流量0.8 L·min－1,載氣流量0.9 L·min－1;可選氣體[20%(體積分?jǐn)?shù))氧氣,底氣為氬氣]的體積分?jǐn)?shù)為30%(稀釋氣為氬氣),用于消耗多余的有機(jī)相;采樣錐為鉑錐;炬管為有機(jī)進(jìn)樣專用炬管;采樣深度8 mm;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.3 r·s－1;積分時(shí)間(206Pb、207Pb、208Pb)1.0 s。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鉛形態(tài)的測定

將煙草樣品磨碎成末,稱取1 g樣品于25 mL棕色具塞三角瓶中,加入15 mL流動(dòng)相,于40 ℃超聲萃取20 min。以6 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液過0.22μm 濾膜,按照儀器工作條件測定。

1.3.2 鉛總量的測定

將煙草樣品磨碎成末,稱取0.3 g(精確至0.1 mg)樣品于消解罐中,依次加入5 mL 硝酸和2 mL 30%過氧化氫溶液,密封,置于微波消解儀中,按表1微波消解程序消解。冷卻后,將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL塑料容量瓶中,用水沖洗消解罐3次,清洗液合并至容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻后按ICP-MS條件測定。

表1 微波消解升溫程序Tab.1 Temperature program of microwave digestion

2 結(jié)果與討論

2.1 鉛同位素的選擇

按照試驗(yàn)方法對加標(biāo)量為10μg·g－1的煙草樣品進(jìn)行分析,過程中對206Pb、207Pb、208Pb等3 種主要鉛同位素進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測。結(jié)果顯示:3種鉛形態(tài)中3種同位素質(zhì)譜響應(yīng)值之比接近其自然豐度比,說明多原子離子等干擾對測定影響較小。為減少不同來源的實(shí)際樣品中鉛同位素比例差異對測定的影響,試驗(yàn)以3種鉛同位素含量之和進(jìn)行定量。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱柱長

基于文獻(xiàn)[18],試驗(yàn)采用ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱,固定色譜柱內(nèi)徑為4.6 mm,考察了色譜柱柱長分別為50,100,150,200 mm 時(shí)對3種鉛形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知:柱長為50 mm 時(shí),Pb(Ⅱ)和TML

圖1 色譜柱柱長對3種鉛形態(tài)分離效果的影響Fig.1 Effect of chromatographic column length on the separation of 3 lead species

不能實(shí)現(xiàn)基線分離;柱長為100,150,250 mm 時(shí),3種鉛形態(tài)均可實(shí)現(xiàn)有效分離。綜合考慮響應(yīng)值、分離時(shí)間及成本,試驗(yàn)選擇ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱的柱長為100 mm。

2.2.2 水相1-戊烷磺酸鈉溶液濃度

利用反相色譜分離鉛化合物時(shí),通常使用有機(jī)相和水相的混合溶液配制流動(dòng)相,其中水相多采用低濃度水平的酸性緩沖溶液、離子對試劑、EDTA的混合溶液[16,19]。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用單一離子對試劑1-戊烷磺酸鈉即可實(shí)現(xiàn)3種鉛形態(tài)的分離。故試驗(yàn)進(jìn)一步考察了水相1-戊烷磺酸鈉溶液的濃度分別為0,1,2,4 mmol·L－1時(shí)對3種鉛形態(tài)的分離效果的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 1-戊烷磺酸鈉溶液濃度對3種鉛形態(tài)分離效果的影響Fig.2 Effect of concentration of sodium 1-pentane sulfonate solution on the separation of 3 lead species

由圖2可知:當(dāng)流動(dòng)相中不添加1-戊烷磺酸鈉時(shí),Pb(Ⅱ)和TML 保留時(shí)間很接近,分離效果差;濃度增至1 mmol·L－1后,Pb(Ⅱ)和TML 的分離度顯著增加,3種鉛形態(tài)均得到較好分離;濃度繼續(xù)增加,Pb(Ⅱ)峰形逐漸鈍化并發(fā)生分裂。因此,試驗(yàn)選擇1-戊烷磺酸鈉溶液的濃度為1 mmol·L－1。

2.2.3 流動(dòng)相酸度

試驗(yàn)考察了流動(dòng)相酸度分別為pH 2.5,3.5,4.5,5.5 時(shí)對3種鉛形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 流動(dòng)相酸度對3種鉛形態(tài)分離效果的影響Fig.3 Effect of mobile phase acidity on the separation of 3 lead species

由圖3可知:當(dāng)pH 為2.5時(shí),Pb(Ⅱ)、TML的分離效果不佳,且響應(yīng)值偏低;pH 為3.5～4.5時(shí),Pb(Ⅱ)、TML的響應(yīng)值增加,分離效果變好;當(dāng)p H升至5.5時(shí),3種鉛形態(tài)的保留時(shí)間變化不大,但是Pb(Ⅱ)的響應(yīng)值明顯降低?？紤]到色譜柱的運(yùn)行環(huán)境酸度不宜過大,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相酸度為pH 4.5。

2.2.4 有機(jī)相及其體積分?jǐn)?shù)

一般選擇甲醇或乙腈作為鉛形態(tài)分析的色譜流動(dòng)相中的有機(jī)相,試驗(yàn)結(jié)果顯示,二者產(chǎn)生的峰形并無顯著差異,考慮到乙腈較甲醇更易產(chǎn)生積炭[20],試驗(yàn)選擇甲醇作為有機(jī)相。

試驗(yàn)還考察了甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為10%,20%,30%,40%,50%時(shí)對3種鉛形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖4。

由圖4 可知:有機(jī)相的體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí),30 min內(nèi)僅有Pb(Ⅱ)流出,分離時(shí)間過長;當(dāng)有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)增至20%時(shí),3種鉛形態(tài)分離效果較好,且均在20 min內(nèi)出峰;有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,Pb(Ⅱ)保留時(shí)間基本不變,另2 種有機(jī)鉛特別是TEL保留時(shí)間顯著縮短;當(dāng)有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)增至50%時(shí),Pb(Ⅱ)和TML 色譜峰重疊。綜合考慮分離度和分離時(shí)間,試驗(yàn)選擇的有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖4 有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)對3種鉛形態(tài)分離效果的影響Fig.4 Effect of volume fraction of organic phase on the separation of 3 lead species

2.2.5 流動(dòng)相流量

試驗(yàn)考察了流動(dòng)相流量分別為0.6,0.8,1.0,1.2 mL·min－1時(shí)對3種鉛形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 流動(dòng)相流量對3種鉛形態(tài)分離效果的影響Fig.5 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 3 lead species

由圖5可知:當(dāng)流動(dòng)相流量為0.6 mL·min－1時(shí),3種鉛形態(tài)能夠較好分離,但整體用時(shí)較長;流量繼續(xù)增加,3種鉛形態(tài)保留時(shí)間均有小幅縮短;當(dāng)流量增加至1.2 mL·min－1時(shí),3種鉛形態(tài)響應(yīng)值降低。綜合考慮響應(yīng)值、分離時(shí)間和色譜柱的使用穩(wěn)定性,試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相流量為1.0 mL·min－1。

2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

為避免樣品分析過程中溶劑轉(zhuǎn)化造成目標(biāo)分析物的損失,試驗(yàn)以色譜流動(dòng)相作為煙草樣品萃取液,并考察了不同萃取方法(超聲萃取法、微波輔助萃取法)、萃取液體積(5,10,15,20 mL)、萃取溫度(20,30,40,50 ℃)以及萃取時(shí)間(10,20,30,40 min)等對加標(biāo)煙草樣品(加標(biāo)量為10μg·g－1)中不同形態(tài)鉛萃取效率的影響。結(jié)果顯示:2種萃取方法所得萃取效率無顯著差別,但超聲萃取法操作更便捷;萃取效率隨萃取液體積的增加逐漸上升,但萃取液體積增至15 mL時(shí),繼續(xù)增加則對提取效果影響不大;在40 ℃下萃取20 min時(shí),萃取效率達(dá)到最大,當(dāng)萃取溫度及萃取時(shí)間繼續(xù)增加,萃取效率變化不大。綜合考慮萃取效率、檢出限和分析用時(shí)等因素,試驗(yàn)選擇采用15 mL 流動(dòng)相在40 ℃下超聲萃取20 min來處理樣品。

按照優(yōu)化的試驗(yàn)條件分析5 mg·L－1鉛形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和煙草樣品,結(jié)果見圖6。

圖6 鉛形態(tài)色譜圖Fig.6 Chromatogram of the lead species

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L－1的3種鉛形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各鉛形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:3種鉛形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為0.5～50.0μg·L－1,其他線性參數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),所得結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對煙草樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

由表3可知:3種鉛形態(tài)的回收率為81.9%～96.5%,RSD 為5.3%～9.6%,表明方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均較好,能夠滿足實(shí)際分析需求。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

選取煙葉樣品上、中、下部,分別標(biāo)記為煙葉1,煙葉2和煙葉3;另取3個(gè)卷煙成品的煙絲,分別標(biāo)記為卷煙Ⅰ、卷煙Ⅱ和卷煙Ⅲ,按照試驗(yàn)方法測定。每個(gè)樣品平行測定6次,取其平均值作為3種鉛形態(tài)的測定值,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples

由表4可知,煙葉樣品及卷煙成品中均未檢出有機(jī)鉛,其鉛形態(tài)以無機(jī)鉛為主,且含量均較低(1.53～5.08μg·g－1);煙草樣品中鉛含量按照部位劃分由下到上呈遞減分布,下部煙葉中鉛含量最高,上部煙葉中鉛含量較低;值得注意的是,卷煙成品中的鉛含量與煙葉樣品的基本處于相同水平,說明煙葉加工過程不會造成鉛形態(tài)的轉(zhuǎn)化,也未引入其他新的鉛形態(tài);檢出鉛形態(tài)含量總和占鉛總量的74.3%～84.6%,說明本方法提取出的鉛含量較高,可用于煙草中鉛形態(tài)的分析。

本工作建立了HPLC-ICP-MS 測定煙草中Pb(Ⅱ)、TML 和TEL 含量的方法。通過對前處理、待測元素同位素、色譜柱、流動(dòng)相離子對試劑、流動(dòng)相酸度、流動(dòng)相中有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)、流動(dòng)相流量等條件的優(yōu)化,在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了3種鉛形態(tài)的分離。本工作將鉛形態(tài)分析引入煙草行業(yè)關(guān)注范圍,可為行業(yè)現(xiàn)有的重金屬元素分析工作提供有益參考。