藏豬妊娠期乳腺形態(tài)和乳腺發(fā)育的標(biāo)志蛋白表達(dá)、相關(guān)激素及信號(hào)通路的變化

楊 強(qiáng)，鄭吉松，郎立敏，王 玥，朱曉彤，束 剛，王麗娜，高 萍，江青艷，王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

藏豬是少有的高原型地方豬種，是我國(guó)寶貴的地方品種資源[1]。據(jù)調(diào)查，藏豬產(chǎn)仔數(shù)并不低，母豬的營(yíng)養(yǎng)水平低下和乳腺發(fā)育不佳以及生存條件較惡劣可能是導(dǎo)致仔豬死亡率高的主要原因[2]。乳腺的良好發(fā)育是正常泌乳的前提，仔豬的存活率與母豬的乳腺發(fā)育密不可分。因此，研究藏豬妊娠期乳腺發(fā)育狀況對(duì)于判斷乳腺是否正常發(fā)育以及提高藏豬繁殖能力具有重要意義。

妊娠期是母豬乳腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，特別是妊娠后1/3階段，即妊娠75 d后，乳腺快速發(fā)育，其質(zhì)量快速增加，乳腺結(jié)構(gòu)由懷孕初期的以脂肪細(xì)胞為主轉(zhuǎn)化為懷孕后期以導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)為主[3]；妊娠期乳腺發(fā)育受到雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)、催乳素 (Prolactin，PRL)[4]等激素的調(diào)控。E2對(duì)于乳腺導(dǎo)管的伸長(zhǎng)和分支具有重要作用[5]；P與E2相似，由卵巢分泌，調(diào)控乳腺組織的導(dǎo)管分枝、腺泡形成[6]；PRL促進(jìn)乳腺腺泡的發(fā)育及乳汁的分泌[7-8]。此外，在信號(hào)通路方面，PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在乳腺細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[9-11]。Jak2/STAT5信號(hào)通路對(duì)乳腺腺泡的生成和多種乳汁蛋白基因的轉(zhuǎn)錄有著重要的調(diào)控作用[12-13]。但是，目前對(duì)于藏豬妊娠期乳腺的發(fā)育情況及激素和信號(hào)通路調(diào)控尚不清楚。

本試驗(yàn)以藏豬為對(duì)象，選取妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)，在研究乳腺發(fā)育形態(tài)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索不同時(shí)間點(diǎn)血清中E2、P、PRL的水平，乳腺中激素受體的表達(dá)及乳腺發(fā)育關(guān)鍵信號(hào)通路PI3K/Akt和Jak2/STAT5的變化。研究旨在初步探究妊娠期藏豬乳腺發(fā)育過(guò)程及其潛在調(diào)控機(jī)制，為日后藏豬乳腺發(fā)育規(guī)律的揭示和地方品種的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

妊娠藏豬選取 4個(gè)時(shí)間點(diǎn) (妊娠 33、50、75和90 d)進(jìn)行屠宰采樣，采集血后離心取血清，采集第3、4對(duì)乳腺組織提取蛋白質(zhì)，取第4對(duì)靠近乳頭部乳腺進(jìn)行石蠟切片染色。

1.2 試驗(yàn)材料

雌二醇、孕酮和催乳素ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司；催乳素受體(Prolactin receptor,PRLR)(貨號(hào)：382057)、雌激素受體(Estrogen receptor,ER)(貨號(hào)：220467)、孕酮受體(Progesterone receptor, PR)(貨號(hào)：220124)抗體購(gòu)于正能生物有限公司，蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2, Jak2)(貨號(hào)：3230)、磷酸化蛋白酪氨酸激酶 2 (p-Jak2)(貨號(hào)：3771)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(Signal transducers and activators of transduction 5,STAT5)(貨號(hào)：9359)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 5 (p-STAT5)(貨號(hào)：4322)、磷脂酰肌醇三激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)(貨號(hào)：4249)、磷酸化磷脂酰肌醇三激酶(p-PI3K)(貨號(hào)：4228)、蛋白激酶 B (Protein kinase B, AKT)(貨號(hào)：9272)和磷酸化蛋白激酶B (p-AKT)(貨號(hào)：4060)抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；蘇木素染液、伊紅染液、蘇木素分化液和蘇木素返藍(lán)液購(gòu)于塞維爾生物公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自白泰克生物技術(shù)有限公司(北京)；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

乳腺采集和HE染色：切下右側(cè)乳腺腹腺體(第4對(duì)乳腺)，體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

蛋白質(zhì)免疫印跡 (Western blot)：按照每 10 μg乳腺組織加入100 μL裂解液進(jìn)行勻漿，試劑盒抽提法提取蛋白質(zhì)，按照BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，調(diào)整蛋白濃度并用5×loading buffer制樣，按照每孔20 μg總蛋白上樣電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上后封閉，孵育一抗過(guò)夜，并用TBST緩沖液洗凈孵育二抗，TBST緩沖液洗凈后按照ECL化學(xué)發(fā)光底物說(shuō)明書1∶1配置工作液，使PVDF膜與其充分反應(yīng)30 s，置于曝光儀中曝光顯色并拍照。

血清激素檢測(cè)：按照南京建成ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)；加入準(zhǔn)備好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和生物素抗原，37 ℃ 條件下反應(yīng) 30 min；洗板 5 次，加入親和素?HRP，37 ℃ 條件下反應(yīng) 30 min；洗板 5 次，加入顯色液 A、B，37 ℃ 條件下顯色 10 min；加入終止液；10 min 之內(nèi)讀取D450 nm，計(jì)算濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SigmaPlot 12.5軟件分析，采用單因素方差分析，并用Duncan’s法對(duì)各組進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏豬妊娠期乳腺形態(tài)變化

乳腺HE染色結(jié)果如圖1所示，妊娠33 d時(shí)，藏豬乳腺中主要是導(dǎo)管結(jié)構(gòu)；50 d時(shí)，乳腺中出現(xiàn)少量腺泡結(jié)構(gòu)；75 d時(shí)，乳腺中腺泡結(jié)構(gòu)快速增多；至90 d時(shí)，乳腺中主要是腺泡結(jié)構(gòu)。

圖 1 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺形態(tài)Fig. 1 Mammary gland morphology in Tibetan pigs at different time points during gestation

2.2 藏豬妊娠期乳腺發(fā)育標(biāo)志蛋白的表達(dá)

利用Western blot方法檢測(cè)了藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺發(fā)育標(biāo)志蛋白Elf-5和PLIN2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在妊娠50、75和90 d時(shí)，Elf-5蛋白表達(dá)水平顯著高于33 d；PLIN2的蛋白水平在75和90 d時(shí)顯著高于 33 d (圖 2、圖 3)。

圖 2 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺發(fā)育標(biāo)志蛋白的電泳圖Fig. 2 Electropherograms of marker protein for mammary gland development at different time points during gestation in Tibetan pigs

圖 3 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺發(fā)育標(biāo)志蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expressions of marker proteins for mammary gland development at different time points during gestation in Tibetan pigs

2.3 藏豬妊娠期血清激素水平

如表1所示，妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)藏豬血清中E2、P和PRL的水平隨著妊娠的進(jìn)行呈升高趨勢(shì)。其中E2水平逐漸升高，到妊娠90 d達(dá)到最高水平，為 42.82 ng/L；P 水平在 75和 90 d顯著高于 33和50 d，90 d P 水平達(dá)到 36.76 μg/L；PRL 水平在 50 d升高，75 d 顯著高于 33 d 但與 50 d 無(wú)顯著差異，90d 時(shí)達(dá)到最高，為 66.53 μg/L，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。

表 1 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)的血清激素水平1)Table 1 Serum hormone levels at different time points during gestation in Tibetan pigs

2.4 藏豬妊娠期激素受體的蛋白表達(dá)模式

利用Western blot方法檢測(cè)了藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺中激素受體的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，妊娠50 d時(shí)PRLR表達(dá)水平顯著高于33 d，在90 d時(shí)達(dá)到最高；ER表達(dá)水平在50 d時(shí)顯著增加，在 50、75 和 90 d 時(shí)水平相當(dāng)；在 75 d 時(shí)PR 表達(dá)水平顯著高于 33 和 50 d，在 90 d 時(shí)達(dá)到更高 (圖 4、圖 5)。

圖 4 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺中激素受體電泳圖Fig. 4 Electropherograms of the hormone receptors at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

圖 5 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺中激素受體蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expressions of the hormone receptors at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

2.5 藏豬妊娠期乳腺發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路變化

利用Western blot方法檢測(cè)藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路Jak2/STAT5和PI3K/AKT的激活情況。由圖6、圖7可知，妊娠75 d時(shí)，Jak2、STAT5、PI3k和AKT的磷酸化水平顯著升高，90 d時(shí)，Jak2、STAT5和 PI3k的磷酸化水平顯著升高，提示Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號(hào)通路被顯著激活。

圖 6 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺中Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的電泳圖Fig. 6 Electropherograms of proteins from Jak2/STAT5 and PI3K/AKT signaling pathways at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

圖 7 藏豬妊娠期不同時(shí)間點(diǎn)乳腺中Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號(hào)通路的蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expressions of proteins from Jak2/STAT5 and PI3K/AKT signaling pathways at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

3 討論與結(jié)論

3.1 藏豬妊娠期乳腺形態(tài)變化及發(fā)育標(biāo)志蛋白的表達(dá)模式

妊娠期是母豬乳腺發(fā)育的重要時(shí)期。我們的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠33 d時(shí)，藏豬乳腺中主要是導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，50 d時(shí)出現(xiàn)少量腺泡結(jié)構(gòu)，75 d時(shí)腺泡快速增多，90 d時(shí)乳腺中主要是腺泡結(jié)構(gòu)。與我們的研究結(jié)果類似的是，Ji等[14]研究發(fā)現(xiàn)，母豬乳腺在妊娠45 d僅 316 g，75 d 乳腺質(zhì)量達(dá) 1606 g，90 d 達(dá)到 2357 g；此外，Kensinger等[15]研究表明，母豬乳腺在90 d時(shí)，腺泡數(shù)量達(dá)到最大，在90～105 d，乳腺腺泡開(kāi)始分泌并蓄積大量乳汁，泌乳活動(dòng)即將開(kāi)始等。高慧杰等[16]在奶山羊的妊娠前期也發(fā)現(xiàn)乳腺并沒(méi)有進(jìn)入快速增殖分化階段，而是代謝和呼吸作用增強(qiáng)，妊娠中期有大量細(xì)胞增殖分化。

Elf-5在妊娠期和哺乳期對(duì)乳腺腺泡的增殖和分化有重要作用，是調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育中必不可少的調(diào)控因子[17-18]。PLIN2是調(diào)控乳脂生成的關(guān)鍵分子[19]。我們的研究結(jié)果顯示，Elf-5和PLIN2在妊娠50 d后表達(dá)量顯著升高，結(jié)合乳腺的形態(tài)和Elf-5、PLIN2蛋白水平 ，說(shuō)明 50 d 乳腺開(kāi)始發(fā)育出腺泡，75 d 乳腺進(jìn)入快速發(fā)育的階段，90 d達(dá)到更高的發(fā)育程度，其中主要是腺泡結(jié)構(gòu)。

3.2 藏豬妊娠期血清激素水平、乳腺激素受體及關(guān)鍵信號(hào)通路的蛋白表達(dá)模式

妊娠期乳腺發(fā)育受到多種激素的調(diào)節(jié)，其中，E2、P是調(diào)節(jié)妊娠期乳腺發(fā)育的主要激素，PRL是調(diào)節(jié)泌乳期乳腺發(fā)育及泌乳的的主要激素[5-6]。激素通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，若敲除其受體，則乳腺無(wú)法正常發(fā)育[20]。方莉莉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在牦牛的妊娠早中期，PR在乳腺組織中表達(dá)量較少，與本文藏豬妊娠早中期PR蛋白表達(dá)較少一致。本文研究結(jié)果顯示，E2、P和PRL等激素及其受體在妊娠期呈升高趨勢(shì)，與乳腺的發(fā)育程度相吻合。類似地，Horigan等[22]通過(guò)體外給卵巢切除并抑制PRL分泌的豬注射 E2、P、E2+PRL、E2+PRL+P，結(jié)果表明，注射E2+PRL+P這3種激素的組合方式才能最大程度地促進(jìn)乳腺導(dǎo)管和腺泡產(chǎn)生，說(shuō)明E2、P和PRL之間的相互作用對(duì)母豬乳腺發(fā)育起著關(guān)鍵作用。

PI3K/Akt和Jak2/STAT5信號(hào)通路在乳腺發(fā)育中起著重要調(diào)控作用。其中，PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化等細(xì)胞過(guò)程[9, 23]。Meng 等[10-11]研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)乳腺發(fā)育和乳腺細(xì)胞的增殖具有重要作用。此外，JAK2/STAT5信號(hào)通路對(duì)乳腺腺泡的生成和多種乳汁蛋白基因的轉(zhuǎn)錄有著重要的調(diào)控作用[12-13]。我們的研究結(jié)果表明，PI3K/Akt和Jak2/STAT5信號(hào)通路在妊娠75 d后被顯著激活，這與乳腺的高度發(fā)育及泌乳活動(dòng)的開(kāi)始有關(guān)。Palin等[24]的研究表明，梅山豬與大白豬乳腺組織實(shí)質(zhì)中STAT5A和STAT5B的表達(dá)水平存在差異，STAT5發(fā)生磷酸化后易位至細(xì)胞核，與產(chǎn)乳靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活并維持泌乳，梅山豬妊娠期乳腺組織中STAT5A和STAT5B的表達(dá)水平更高，能夠生成更多的磷酸二聚體易位至核，同時(shí)梅山豬乳腺發(fā)育情況更好，具有更高的泌乳力。

綜上所述，本文研究了藏豬妊娠期乳腺形態(tài)和乳腺發(fā)育標(biāo)志蛋白、相關(guān)激素及信號(hào)通路的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在藏豬妊娠過(guò)程中，其乳腺在妊娠50 d開(kāi)始腺泡發(fā)育，75 d乳腺進(jìn)入腺泡快速發(fā)育期，90 d發(fā)育程度更高，同時(shí)伴隨著血清中乳腺發(fā)育相關(guān)激素(E2、P和PRL)和乳腺中激素受體表達(dá)的顯著升高，以及乳腺發(fā)育相關(guān)通路PI3K/AKT和Jak2/STAT5的激活。研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)藏豬的乳腺發(fā)育和繁殖功能奠定了科學(xué)依據(jù)，為保護(hù)藏豬資源奠定了理論基礎(chǔ)。