lncRNA UCA1通過激活miR-143/HK2通路促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖、侵襲和EMT

張永紅，李存濤，張玉紅，姚麗

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450000

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是一種源自表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚腫瘤［1］，大部分患者在診斷時已發(fā)展為侵襲性CSCC［2］。這些高轉(zhuǎn)移性疾病的長期預(yù)后非常差，疾病特異性生存率為44.56%。因此，尋找新的診斷生物標(biāo)志物，從而提高CSCC的治療效果迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼調(diào)控RNA［3］。研究表明lncRNA在染色體失活、基因組印記和發(fā)育等生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用［4-5］。最近，越來越多的報道顯示許多失調(diào)的lncRNA參與了人類癌癥的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和轉(zhuǎn)移［6-7］。例如，lncRNA PVT1高表達(dá)在食管癌中通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)侵襲［8］，而lncRNA PANDAR表達(dá)升高對結(jié)直腸癌預(yù)后不良，并通過EMT途徑促進(jìn)轉(zhuǎn)移［9］。UCA1首次被確定為膀胱癌的致癌lncRNA。UCA1在乳腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等多種癌癥中高表達(dá)［10-11］，提示UCA1的高表達(dá)可能是預(yù)測這些癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)記。一些研究也表明UCA1的上調(diào)與乳腺癌和膀胱癌的EMT相關(guān)，但UCA1在CSCC中的表達(dá)及其潛在機制仍不清楚。本研究旨在探討lncRNA UCA1對皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的表達(dá)及其對癌細(xì)胞增殖、侵襲及其EMT的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

40例CSCC和28例癌旁正常組織標(biāo)本均來自本院，收集的標(biāo)本經(jīng)患者同意和本單位倫理委員會批準(zhǔn)，保存在液氮中用于后續(xù)實驗。人皮膚鱗癌細(xì)胞(A431細(xì)胞)和人正常皮膚細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒來自美國Abcam公司；改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco＇s Modified Eagle Medium，DMEM)為美國Gibco公司產(chǎn)品、長鏈非編碼RNA UCA1下調(diào)質(zhì)粒(UCA1 siRNA)；長鏈非編碼RNA UCA1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-UCA1)、miR-143抑制劑(miR-143 inhibitor)、miR-143模擬物(miR-143 mimics)、己糖激酶Ⅱ下調(diào)質(zhì)粒(HexokinaseⅡsiRNA，HK2 siRNA)等由Genepharma公司合成；鈣粘附蛋白E(E-cadherin)、鈣粘附蛋白N(N-cadherin)、GAPDH多克隆抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；Turbofect為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞，各組細(xì)胞放置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)基每2 d更換1次，長滿后及時消化細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染用10%FBS的DMEM稀釋長滿的細(xì)胞，接種于12孔板，觀察細(xì)胞生長至約70%時，用無血清的DMEM培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞單層，利用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按實驗要求，所有細(xì)胞在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育一定時間后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞活力測定將各組細(xì)胞按4×103/孔的密度接種至96孔板中，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞48 h后，吸去每孔培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，每孔加入20μL MTT，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸去上清液，每孔細(xì)胞中加入150μL DMSO，在37℃搖床中充分搖動10 min，在酶標(biāo)儀下讀取490 nm處的吸收峰。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測首先構(gòu)建lncRNA UCA1 wt載體和HK2 wt載體，利用點突變試劑盒突變質(zhì)粒，構(gòu)建lncRNA UCA1 mut和HK2 mut載體。A431細(xì)胞稀釋并接種于12孔板，觀察細(xì)胞密度為70%～75%時，將lncRNA UCA1 wt、lncRNA UCA1 mut分別與miR-143 mimics、mimics NC質(zhì)粒，HK2 wt、HK2 mut分別與miR-199a-5p mimics、mimics NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞，48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實驗用Turbofect將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞48 h后，重懸細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，預(yù)先加入100μL基底膠(Matrigel)于Transwell上室中，再將1×105個稀釋后的細(xì)胞加入其中，下室中加入600μL完全DMEM培養(yǎng)基，24 h后取小室，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，吸去固定液后加入PBS洗滌3次，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，隨機選取計數(shù)5個視野中的細(xì)胞數(shù)觀察并計數(shù)。

1.2.6 實時定量PCR收集各組細(xì)胞，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix)將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher)檢測PCR產(chǎn)物，每組設(shè)置3個復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參。實驗所用的引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.7 Western blot用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime)在酶標(biāo)儀中測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液變性10 min后，取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用封閉液(5%脫脂奶粉)將膜封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入特異性一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，膜清洗干凈后進(jìn)行蛋白曝光，應(yīng)用Image J軟件對膜上蛋白質(zhì)條帶的灰度值進(jìn)行檢測分析，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，至少取3次獨立實驗結(jié)果。lncRNA UCA1 siRNA與siRNA NC，HK2 siRNA與siRNA NC，miR-143 inhibitor與inhibitor NC等兩組間比較采用配對t檢驗；mimics NC+UCA1 wt組和UCA1 wt+miR-143 mimics組、mimics NC+UCA1 mut組和UCA1 mut+miR-143 mimics組、mimics NC+HK2 wt組和HK2 wt+miR-143 mimics組、mimics NC+HK2 mut組和HK2 mut+miR-143 mimics組等兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)lncRNA UCA1抑制A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR結(jié)果顯示，lncRNA UCA1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)量為2.89±0.46，在癌旁正常組織中表達(dá)量為1.23±0.72，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.65，P=0.002)；A431細(xì)胞中的lncRNA UCA1表達(dá)量為1.86±0.52，HaCaT細(xì)胞中為0.94±0.38，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.06，P=0.002)。lncRNA UCA1 siRNA、siRNA NC組細(xì)胞內(nèi)UCA1表達(dá)量分別為0.45±0.73和1.12±0.38，表明lncRNA UCA1 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。UCA1 siRNA組A431細(xì)胞增殖能力明顯低于siRNA NC組(t=25.78，P=0.001)；與siRNA NC組相比，UCA1 siRNA組Ncadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(t=18.74，P=0.004)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=23.58，P=0.001)；與siRNA NC組相比，UCA1 siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(t=19.75，P=0.003)。見圖1A～1C。

圖1 下調(diào)lncRNA UCA1抑制A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 1A：MTT法檢測下調(diào)lncRNA UCA1對A431細(xì)胞增殖的影響；1B：Western blot實驗檢測下調(diào)lncRNA UCA1對A431細(xì)胞EMT的影響；1C：Transwell檢測下調(diào)lncRNA UCA1對A431細(xì)胞侵襲的影響Figure 1 Down-regulation of lncRNA UCA1 inhibits proliferation，invasion and EMT of A431 cells．1A：The effect of down-regulation of lncRNA UCA1 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；1B：Western blot was used to detect the effect of down-regulating lncRNA UCA1 on EMT of A431 cells；1C：The effect of down-regulating lncRNA UCA1 on the invasion of A431 cells was detected by transwell．

2.2 lncRNA UCA1與miR-143之間的關(guān)系

圖2為miRanda預(yù)測的UCA1和miR-143之間的結(jié)合位點。與mimics NC+UCA1 wt組相比，UCA1 wt+miR-143 mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(t=28.41，P=0.001)；與mimics NC+UCA1 mut組相比，UCA1 mut+miR-143 mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(t=0.97，P=0.434)。RT-qPCR結(jié)果顯示：UCA1 siRNA組細(xì)胞內(nèi)miR-143表達(dá)量明顯高于siRNA NC組(1.82±0.45比0.97±0.36，t=12.26，P=0.006)；pcDNA-UCA1組細(xì)胞內(nèi)miR-143表達(dá)量明顯低于pcDNA-3.1(+)組(0.37±0.26比0.98±0.34，t=11.52，P=0.007)，表明lncRNA UCA1與miR-143之間具有負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖2 預(yù)測lncRNA UCA1與miR-143之間的結(jié)合位點Figure 2 Prediction of binding sites between lncRNA UCA1 and miR-143．

2.3 下調(diào)miR-143促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR結(jié)果顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌中miR-143表達(dá)量為0.45±0.34，癌旁正常組織中為1.05±0.92，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.60，P=0.006)；A431細(xì)胞中的miR-143表達(dá)量為0.56±0.76，HaCaT細(xì)胞中為1.24±0.37，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.68，P=0.007)。miR-143 inhibitor、inhibitor NC組細(xì)胞內(nèi)miR-143表達(dá)量分別為0.37±0.79和1.04±0.34，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.46，P=0.003)。miR-143 inhibitor組A431細(xì)胞增殖能力明顯高于inhibitor NC組(t=19.80，P=0.002)；與inhibitor NC組相比，miR-143 inhibitor組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(t=20.06，P=0.002)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=18.82，P=0.002)；與inhibitor NC組相比，miR-143 inhibitor組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(t=15.53，P=0.004)，見圖3A～3C。

圖3 下調(diào)miR-143促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 3A：MTT法檢測下調(diào)miR-143對A431細(xì)胞增殖的影響；3B：Western blot實驗檢測下調(diào)miR-143對A431細(xì)胞EMT的影響；3C：Transwell檢測下調(diào)miR-143對A431細(xì)胞侵襲的影響Figure 3 Down-regulation of miR-143 promotes proliferation，invasion and EMT of A431 cells．3A：The effect of downregulation of miR-143 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；3B：The effect of down-regulating miR-143 on EMT of A431 cells was detected by Western blot assay；3C：Effect of down-regulation of miR-143 on A431 cell invasion was detected by transwell．

2.4 上調(diào)lncRNA UCA1通過miR-143促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT

RT-qPCR結(jié)果顯示，pcDNA-3.1(+)、pcDNA-UCA1組的UCA1表達(dá)量分別為1.19±0.86和2.46±1.27，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.38，P=0.002)。pcDNA-UCA1+mimics NC組A431細(xì)胞增殖能力和侵襲數(shù)目明顯高于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組(t值分別 為20.98、23.27，P值均＜0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics組細(xì)胞增殖能力和侵襲數(shù)目明顯低于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組(t值 分 別 為7.06、20.79，P值均＜0.01)，pcDNA-UCA1+miR-143 mimics組細(xì)胞增殖能力和侵襲數(shù)目明顯高于pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics組(t值分別為16.72、6.03，P值均＜0.01)，見圖4A、4B。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNAUCA1+mimics NC組N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=13.35，P=0.006)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=24.20，P=0.002)，pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=14.12，P=0.005)，N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=13.79，P=0.005)；與pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics組相比，pcDNAUCA1+miR-143 mimics組N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=30.14，P=0.001)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降(t=23.48，P=0.002)，見圖4C。

圖4 上調(diào)lncRNA UCA1通過miR-143促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 4A：Transwell檢測上調(diào)lncRNA UCA1通過miR-143對A431細(xì)胞侵襲的影響；4B：MTT法檢測上調(diào)lncRNA UCA1通過miR-143對A431細(xì)胞增殖的影響；4C：Western blot實驗檢測上調(diào)lncRNA UCA1通過miR-143對A431細(xì)胞EMT的影響Figure 4 Upregulation of lncRNA UCA1 promotes proliferation，invasion and EMT of A431 cells through miR-143．4A：Transwell was used to assess the effect of upregulation of lncRNA UCA1 on A431 cell invasion through miR-143；4B：The effect of upregulation of lncRNA UCA1 through miR-143 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；4C：Western blot was used to detect the effect of upregulated lncRNA UCA1 on EMT of A431 cells through miR-143．

2.5 miR-143與HK2之間的關(guān)系

利用TargetScan預(yù)測miR-143與HK2的結(jié)合位點結(jié)果見圖5。與mimics NC+HK2 wt組相比，HK2 wt+miR-143 mimics組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(t=18.38，P=0.003)；與mimics NC+HK2 mut組(1.14±0.04)相比，HK2 mut+miR-143 mimics組(1.18±0.26)細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(t=3.60，P=0.069)。RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-143 inhibitor組細(xì)胞內(nèi)HK2表達(dá)量明顯高于inhibitor NC組(2.13±0.45比1.06±0.28，t=22.15，P=0.002)，miR-143 mimics組細(xì)胞內(nèi)HK2表達(dá)量明顯低于mimics NC組(0.29±0.37比1.13±0.45，t=19.79，P=0.003)，表明miR-143與HK2之間具有負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖5 預(yù)測miR-143與HK2之間的結(jié)合位點Figure 5 Prediction of binding sites between miR-143 and HK2．

2.6 下調(diào)HK2對A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，A431細(xì)胞中的HK2表達(dá)量(2.36±0.47)高于HaCaT細(xì)胞(1.14±0.34)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.31，P=0.001)。siRNA NC、HK2 siRNA組A431細(xì)胞中HK2表達(dá)量分別為1.06±0.38和0.32±0.27，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.55，P=0.002)。

HK2 siRNA組A431細(xì)胞增殖能力明顯低于siRNA NC組(t=8.90，P=0.012)。與siRNA NC組相比，HK2 siRNA組N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低(t=14.94，P=0.005)，E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(t=16.12，P=0.004)；HK2 siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(t=13.79，P=0.005)。見圖6A～6C。

圖6 下調(diào)HK2抑制A431細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT 6A：MTT法檢測下調(diào)HK2對A431細(xì)胞增殖的影響；6B：Western blot實驗檢測下調(diào)HK2對A431細(xì)胞EMT的影響；6C：Transwell檢測下調(diào)HK2對A431細(xì)胞侵襲的影響Figure 6 Down-regulation of HK2 inhibits proliferation，EMT，and invasion of A431 cells．6A：The effect of down-regulation of HK2 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；6B：Western blot was used to detect the effect of down-regulating HK2 on EMT of A431 cells；6C：The effect of down-regulating HK2 on the invasion of A431 cells was detected by Transwell．

2.7 lncRNA UCA1通過miR-143上調(diào)HK2表達(dá)

UCA1 siRNA+inhibitor NC組HK2表達(dá)量明顯低于siRNA NC+inhibitor NC組(0.65±0.04比1.25±0.52，t=21.61，P=0.002)；siRNA NC+miR-143 inhibitor組HK2表達(dá)量明顯高于siRNA NC+inhibitor NC組(2.75±0.52比1.25±0.52，t=21.61，P=0.002)；UCA1 siRNA+miR-143 inhibitor組HK2表達(dá)量明顯低于siRNA NC+miR-143 inhibitor組(1.36±0.21比2.75±0.52，t=25.81，P=0.002)。

3 討論

越來越多的報道顯示，lncRNAs表達(dá)異常與包括CSCC在內(nèi)的多種人類癌癥的病理發(fā)展密切相關(guān)。如研究表明lncRNA XLOC_001659在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，敲除lncRNA XLOC_001659可抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲［12］。lncRNA DLX6-AS1通過靶向miR-16-5p/NUCKS1調(diào)控CSCC細(xì)胞A431增殖、遷移和侵襲［13］。UCA1在癌癥中是一個敏感、特異性的致癌lncRNA，在各種癌癥中表達(dá)上調(diào)，UCA1的高表達(dá)參與了許多癌癥的細(xì)胞侵襲和遷移，本研究結(jié)果與有關(guān)UCA1在胰腺癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌等癌癥中表達(dá)的研究結(jié)果一樣［14-15］，UCA1在CSCC組織和細(xì)胞中表達(dá)升高。UCA1的異常表達(dá)提示UCA1與CSCC的發(fā)展密切相關(guān)。EMT是一個很好的特征過程，它促進(jìn)了人類癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。本研究結(jié)果顯示，UCA1敲低能夠抑制A431細(xì)胞的增殖和侵襲，導(dǎo)致E-cadherin升高，N-cadherin降低，而UCA1過表達(dá)導(dǎo)致相反結(jié)果。提示UCA1可能通過促進(jìn)EMT來調(diào)節(jié)CSCC的晚期侵襲。

lncRNAs與miRNA相互作用，發(fā)揮miRNA海綿或抑制劑的作用，并調(diào)節(jié)對miRNA靶點的抑制。越來越多的報道表明，UCA1是一種致癌的lncRNA，它與腫瘤抑制miRNA如miR-507、miR-145、miR-16和miR-216b相互作用并抑制miRNA表達(dá)。基于miRanda和熒光素酶報告基因檢測，可確定腫瘤抑制miR-143基因在UCA1中的結(jié)合位點的3＇UTR。此外，研究結(jié)果顯示，UCA1過表達(dá)在A431細(xì)胞中明顯抑制miR-143的表達(dá)，下調(diào)UCA1明顯上調(diào)了miR-143的表達(dá)。miR-143已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中抑制EMT和細(xì)胞侵襲，從而起抑癌作用包括脊髓膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌、膀胱癌和乳腺癌［16-17］。本研究結(jié)果表明，miR-143在CSCC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)miR-143明顯促進(jìn)A431細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，UCA1可能作為與miR-143競爭的內(nèi)源性RNA，抑制miR-143表達(dá)，從而促進(jìn)CSCC A431細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。提示miR-143作為腫瘤抑制基因和EMT的負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。因此，UCA1可能通過吸附上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化酶相關(guān)miRNA而發(fā)揮癌基因的作用。有研究表明HK2在各種癌癥如胃癌、結(jié)直腸癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18-19］，而本研究結(jié)果表明HK2在A431細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，siRNA干擾HK2表達(dá)后明顯抑制了A431細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

綜上所述，本研究證明了lncRNA UCA1通過激活miR-143/HK21通路促進(jìn)CSCC的增殖、侵襲和EMT，這可能在CSCC A431細(xì)胞的病理中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。