梅毒疫苗研究進展

柯吳堅，鄭剛，塔依爾·吐爾洪，陳永恒，楊斌

1.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844000

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)感染引起的一種可危害全身各組織器官的性傳播疾病［1］。盡管青霉素治療梅毒便宜有效，但最新的流行病學數(shù)據(jù)顯示，全球約1 800萬人感染梅毒，每年新發(fā)梅毒感染者高達560萬例，因此防控梅毒迫在眉睫［2］。除了采用被動藥物治療，能否找到一種有效的預防梅毒感染方法是近年來梅毒研究熱點。但由于Tp外膜蛋白的不穩(wěn)定性、Tp體外培養(yǎng)困難、無法進行基因遺傳編輯等缺點［1］增加了Tp疫苗研究難度。因此與其他病原體疫苗的開發(fā)相比，Tp疫苗研究進展緩慢，目前僅有少數(shù)梅毒研究學者對梅毒疫苗候選基因進行篩選和鑒定。本文將從以下幾方面綜述近年來梅毒疫苗研究進展。

1 早期研究證實梅毒疫苗的可行性

早在上世紀六十年代末期，Metzger等［3］首次采用4℃短期儲存制備減毒Tp，并將處理后的Tp對兔行靜脈內(nèi)和肌內(nèi)免疫接種，結(jié)果顯示該方法可部分保護兔免受Tp感染。研究顯示，嚴酷化學或熱滅活Tp可能破壞Tp脆弱的外膜蛋白，從而無法誘導兔產(chǎn)生免疫保護力。該研究為Tp保護性抗原的不穩(wěn)定性提供了強有力的證據(jù)。通過兔靜脈內(nèi)注射老齡Tp進行免疫接種，免疫后在兔背部再次接種具有傳染性的Tp，兔并沒有形成硬下疳皮損或檢測出Tp；接種老齡Tp兔的淋巴結(jié)進行兔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移實驗，結(jié)果顯示16只兔中，有6只表現(xiàn)出完全免疫保護力［3］。老齡Tp傳染性低且保留了Tp完整外膜蛋白的特點，因此誘導宿主可產(chǎn)生部分甚至是完全的免疫保護作用，提示低傳染性且含有完整的Tp外膜蛋白在疫苗研究的重要性。該研究進一步證實：①肌內(nèi)注射老齡Tp也能提供部分保護作用，但不如靜脈內(nèi)注射有效；②滅活Tp菌量的不同，對誘導兔形成Tp免疫保護作用存在明顯差異，其中1.2×1010Tp菌量免疫接種兔的免疫保護力優(yōu)于3×109～6×109Tp菌量。以上研究表明靜脈免疫和高菌量在Tp誘導宿主產(chǎn)生免疫保護中起著重要作用。由于臨床患者感染Tp量遠低于1.2×1010Tp菌量，因此該研究結(jié)果也進一步解釋了為何臨床患者感染Tp后無法產(chǎn)生足夠的免疫保護力。在上世紀七十年代早期，Miller等［4］完成另一個梅毒疫苗開發(fā)領域的標志性研究，他們通過采用γ射線照射Tp，使其成為無感染性Tp。該方法既保留了完整、易變、脆弱的Tp表面抗原含量，又保留了Tp的運動性，使得Tp免疫兔處于非感染和非增殖性，從而不能建立感染。經(jīng)過以上方法處理后的總量為3.71×109的Tp菌株量免疫兔后，再以同源的Tp感染，結(jié)果顯示：①在感染注射部位沒有出現(xiàn)硬下疳皮損；②淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移實驗陰性；③在免疫后期至少一年內(nèi)仍具有完全保護力；④該保護性對其他Tp株(Haiti B)感染無保護作用。實驗證實該方法可誘導兔形成對相同Tp菌株感染具有完全保護作用，進一步表明梅毒疫苗研究的可行性。綜合早期Tp疫苗研究得出以下結(jié)論：①具有誘導形成免疫保護作用的Tp抗原是熱不穩(wěn)定且脆弱的，因此保護性免疫的形成取決于Tp完整的、未破壞的表面抗原的存在；②高劑量滅活的Tp及長久的免疫計劃(37周)表明Tp外膜蛋白缺乏，需高劑量、重復多次Tp接種才能緩慢形成保護性免疫性；③Tp免疫不能賦予宿主產(chǎn)生對異源性Tp菌株的交叉免疫保護力，表明保護性抗原在病原體之間存在差異性；④在兔模型中證實免疫保護時間持久(長達至少1年)，表明Tp疫苗的可行性。

2 單個Tp抗原作為梅毒疫苗的探索

隨著上世紀九十年代末期Tp基因組測序的完成，選用單個Tp抗原作為Tp疫苗成為可行。已經(jīng)用于驗證Tp免疫保護力的Tp抗原包括Tp92［5-6］、TprK［7-9］、TprI［10］、TprF［11］、Gpd［12］、TmpB［13］、TpN15［14］、TpN47［15］、Tp0155［15］、Tp0483［15］、Tp0956［15］和4D［16］。用Tp92、4D、Gpd和TprF抗原免疫兔表現(xiàn)出硬下疳皮損形成減緩，表明這些抗原具有部分免疫保護作用，但后續(xù)的兔感染實驗證實其缺乏完全免疫保護能力。此外，具有抗原變異的TprK蛋白免疫兔可誘導引起宿主形成抗Tp感染的部分保護作用，分子水平研究顯示保護部分定位于TprK蛋白的N-末端［7-9］。然而不同的研究團隊在研究相同Tp抗原(TprK［17］、Gpd［18］和Tp92［6］)誘導兔形成免疫保護能力的結(jié)果存在差異。根據(jù)梅毒感染兔模型的研究表明，梅毒Tpr蛋白家族成員免疫后的兔在對抗Tp攻擊時，硬下疳皮損形成減弱［9，11］。通過蛋白水平和分子水平預測發(fā)現(xiàn)該蛋白家族特定成員位于Tp外膜表面［19-20］，其蛋白環(huán)型區(qū)域表現(xiàn)出廣泛的序列突變［21］，可引起抗原變異［22］和相變異［23］，表明該蛋白家族特定成員的序列突變在Tp持續(xù)感染和易感個體的Tp再感染中發(fā)揮重要作用。以上研究表明Tp抗原間存在變異將是梅毒疫苗開發(fā)的難點。

3 黏附素抗原對抗梅毒感染中的作用

Tp具有黏附宿主纖連蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅳ的能力早在上世紀八十年代中期得到證實，表明宿主細胞外基質(zhì)成分是Tp黏附的主要目標［24］。直到上世紀九十年代末期，Tp全基因組序列的闡明［25］為參與黏附到細胞外基質(zhì)成分的Tp黏附素的確認鋪平了分子生物學道路，從而識別出4個具有黏附宿主成分的Tp黏附素(Tp0136［26-27］、Tp0155［28］、Tp0483［28-29］和Tp0751［30-34］)。在Tp早期感染過程中，當高度侵襲性的Tp遇到宿主體內(nèi)各種組織成分時，這種多重黏附能力將使其發(fā)揮出廣泛黏附宿主的作用。Tp0136最初注釋為未知功能的假定蛋白［25］，隨后通過多項研究［26-27，35-37］進一步證實：①Tp0136具有黏附細胞纖連蛋白的能力，且黏附細胞纖連蛋白能力強于血漿纖連蛋白；②Tp0136保守的NH2端是主要黏附作用區(qū)；③Tp0136抗體可以抑制Tp黏附到宿主血漿和細胞纖連蛋白；④Tp0136與宿主不同組織細胞系的黏附能力存在差異；⑤Tp0136通過C-C基序配體2(C-C motif ligand 2，CCL2)/C-C基序配體2受體(CCL2 receptor，CCR2)信號通路對纖連蛋白RGD結(jié)構(gòu)域與整合素β1的相互作用促進人微血管內(nèi)皮細胞(human microvascular endothelial，HMEC-1)遷移；⑥Tp0136通 過TLR4、ERK、JNK、PI3K和NF-κB信號通路誘導單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)/CCR2表達促進成纖維細胞遷移，從而促進梅毒硬下疳皮損自愈；⑦高滴度Tp0136抗體可促進炎癥細胞向局部皮損浸潤，加重組織損傷，延緩創(chuàng)面愈合，對梅毒感染缺乏保護作用。Tp0155和Tp0483同樣是具有黏附宿主纖連蛋白能力的Tp黏附素［28-29］，前者可黏附到細胞纖連蛋白，而后者具有黏附血漿或細胞纖連蛋白的能力。通過功能化自組裝單分子膜(functionalized self-assembled monolayers，SAMs)證實Tp0483的274-289和316-333氨基酸序列為主要黏附纖連蛋白作用區(qū)［29］。通過將Tp0155和Tp0483重組蛋白分別接種新西蘭白兔，盡管可獲得高滴度(＞1∶50 000)血清抗體，但該抗體缺乏對梅毒感染保護［6］。大量體外研究［30-34］顯示Tp還可通過Tp0751蛋白黏附到廣泛分布在宿主體內(nèi)的多種層黏連蛋白(包括層黏連蛋白1、2、4、8和10亞型)。使用穿梭載體pKMR4PEMCS將Tp0751轉(zhuǎn)染到無黏附、可體外培養(yǎng)的潰蝕齒密螺旋體上，可賦予異源表達Tp0751的潰蝕齒密螺旋體具有黏附層黏連蛋白的能力；而重組Tp0751抗體可特異性抑制異源表達Tp0751蛋白潰蝕齒密螺旋體黏附層黏連蛋白［31］。Tp0751除了黏附層黏連蛋白還可經(jīng)自催化裂解作用降解層黏連蛋白和纖維蛋白原［30，33-34］。采用全長Tp0751免疫新西蘭白兔，評估Tp0751對局部或播散性Tp感染是否具有保護作用，兩個不同的研究團隊卻得出完全相反的實驗數(shù)據(jù)。Luthra等［38］研究提示Tp0751不能激發(fā)調(diào)理抗體或保護性抗體；而Lithgow等［39］研究顯示Tp0751免疫的新西蘭白兔可對抗Tp感染，是一種有前途的梅毒疫苗候選蛋白。不同實驗室間結(jié)果差異性的存在，提示梅毒疫苗開發(fā)和建立需要一套完善的Tp實驗室標準化操作和驗證流程。

4 結(jié)語

世界范圍內(nèi)梅毒的廣泛持續(xù)流行、特定地區(qū)和男男性行為者梅毒感染率的不斷增加，證明單純依靠公共衛(wèi)生舉措無法有效阻止梅毒蔓延。由于目前對Tp發(fā)病機理了解非常有限，與Tp研究相關技術(shù)復雜，使得梅毒疫苗開發(fā)進展緩慢。雖然梅毒疫苗研發(fā)存在諸多難點，需要一一克服，但相信經(jīng)過政府干預和梅毒研究學者積極參與，通過發(fā)現(xiàn)有希望的新疫苗候選物、優(yōu)化免疫佐劑、增強免疫保護性等方法，在不遠的將來可開發(fā)出明顯降低Tp感染性的梅毒疫苗，從而減少全球梅毒的發(fā)病率。