核糖體蛋白L12(RPL12)在豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制中的作用

殷杰 趙永祥 薛江東 劉鍇 李彬 馬德慧

摘要： 為研究宿主細(xì)胞核糖體蛋白L12（RPL12）在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）復(fù)制中的作用，本研究通過熒光定量PCR和Western-blotting等方法，檢測了PRRSV感染對Marc-145細(xì)胞中RPL12表達的影響，以及過表達或敲減RPL12對PRRSV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，PRRSV感染可上調(diào)Marc-145細(xì)胞中RPL12基因的表達。過表達RPL12可促進PRRSV的復(fù)制，而敲減RPL12可抑制PRRSV的復(fù)制。通過免疫共沉淀和共聚焦顯微鏡檢測，進一步研究發(fā)現(xiàn)RPL12蛋白與PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，并共定位于細(xì)胞質(zhì)中。本研究首次發(fā)現(xiàn)了宿主蛋白RPL12能夠促進PRRSV復(fù)制，并與PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，為進一步研究PRRSV的感染與復(fù)制機制以及與宿主的相互作用提供了新的切入點，為抗病毒藥物的研發(fā)提供了有益的探索。

關(guān)鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）;核糖體蛋白L12（RPL12）;PRRSV GP2b蛋白

中圖分類號： S852.65 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0686-08

Role of ribosomal protein L12（RPL12） in porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication

YIN Jie1，2， ZHAO Yong-xiang2， XUE Jiang-dong1， LIU Kai1， LI Bin2， MA De-hui1

（1.College of Animal Science and Technology， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000， China;2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： To study the role of host cell ribosomal protein L12 （RPL12） in the replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， real-time quantitative PCR and Western-blotting were performed to detect the effect of PRRSV infection on the expression of RPL12 in Marc-145 cells and the effect of over-expression and knockdown of RPL12 on the replication of PRRSV. The results showed that PRRSV infection could up-regulate the expression of RPL12 in Marc-145 cells. Over-expression of RPL12 promoted the replication of PRRSV， while knockdown of the RPL12 inhibited the replication of PRRSV. Through co-immunoprecipitation and confocal microscopy analysis， further study found that RPL12 protein interacted with PRRSV GP2b protein and co-localized in the cytoplasm. This study reported for the first time that the host protein RPL12 could promote PRRSV replication and interact with PRRSV GP2b protein， which provides a new cut-in point for further research on the mechanism of PRRSV infection and replication， and also provides a beneficial exploration for the development of antiviral drugs.

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）;ribosomal protein L12 （RPL12）;PRRSV GP2b protein

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的病原體[1]，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，是冠狀病毒科成員[2]，在分類上屬于動脈病毒屬[3]。該病毒主要引起懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)以及木乃伊胎等繁殖障礙，也會引起公豬精液質(zhì)量下降，仔豬和育肥豬呼吸困難等癥狀[4]。病毒在扁桃體、肺和淋巴器官中持續(xù)復(fù)制，可抑制宿主先天免疫[5-8]。另外，PRRSV經(jīng)常與豬圓環(huán)二型（PCV2）豬瘟等病毒和副豬嗜血桿菌等細(xì)菌存在混合感染[9-11]，而且PRRSV存在毒力返強、變異以及與臨床毒株發(fā)生重組的風(fēng)險，防控難度大，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。目前，PRRSV感染與復(fù)制機制還未完全闡明，特別是宿主蛋白質(zhì)在病毒復(fù)制中的作用的研究尚不深入，解析這些問題有助于理解PRRSV的致病與免疫機制，有助于制定PRRSV防控措施。

PRRSV基因組包含11個已知的開放閱讀框（ORFs）： ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7、ORF5a和transframe （TF） ORF[12-14]。ORF1a和ORF1b的長度約占病毒基因組的三分之二，編碼病毒復(fù)制所必需的16種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs）[15]，這些非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與基因組復(fù)制和亞基因組的合成。ORF2～ORF7編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白[GP2、GP2b、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N]，其中GP2b蛋白完全包裹在ORF2中，是一種小的、非糖基化蛋白質(zhì)，大小只有10 000，但GP2b相對大量存在于病毒粒子中，在2種類型毒株間高度保守[16]，是病毒粒子的重要組成部分[17]。GP2b已被證明與GP4共價結(jié)合，而GP3與GP4結(jié)合形成病毒粒子表面的異三聚體復(fù)合物，被認(rèn)為參與病毒的侵入。因此，GP2b在PRRSV的感染與復(fù)制過程中可能發(fā)揮著重要作用。前期研究中，我們利用PRRSV GP2b作為誘餌蛋白質(zhì)，通過酵母雙雜交試驗在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）cDNA文庫中篩選到了與GP2b蛋白相互作用的核糖體蛋白L12（RPL12），而RPL12在PRRSV復(fù)制過程中的作用尚未明確，需要進一步探索。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可上調(diào)Marc-145（非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞）細(xì)胞中RPL12基因的表達。為了探索RPL12基因與PRRSV復(fù)制之間的關(guān)系，我們過表達和敲減了RPL12基因，發(fā)現(xiàn)過表達RPL12基因促進了PRRSV的復(fù)制，相反，敲減RPL12抑制了PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制。進一步研究發(fā)現(xiàn)RPL12蛋白與PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，并共定位于細(xì)胞質(zhì)中。本研究首次發(fā)現(xiàn)了宿主蛋白質(zhì)RPL12能夠促進PRRSV復(fù)制，并與PRRSV GP2b蛋白存在相互作用，為進一步研究PRRSV的復(fù)制機制及與宿主的相互作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒、抗體 Marc-145、人胚腎A細(xì)胞（293A）、PRRSV JS-15毒株、PRRSV N蛋白抗體均由本實驗室保存。鼠抗β-actin單克隆抗體購自愛博泰克生物科技有限公司。兔抗RPL12單克隆抗體、鼠抗HA單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。鼠單抗FLAG單克隆抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、DIPA染色液購自碧云天生物技術(shù)公司。FITC-山羊抗小鼠IgG、CY3-山羊抗小鼠IgG購自博士德生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌感受態(tài)Trans 5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，干擾片段由銳博生物科技有限公司合成，Plasmid Mini Kit I、Gel Extraction Kit購自廣州飛揚生物工程有限公司，總RNA提取試劑盒（雙柱型）購自廣州美基生物科技有限公司，5×HiSciript II、qRT SuperMix II反轉(zhuǎn)錄酶、AceQ qPCR Probe Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，細(xì)胞高糖培養(yǎng)液DMEM購自上海源培生物科技股份有限公司，SuperSignalTM West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate購自賽默飛世爾科技公司，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 本研究中構(gòu)建了pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS-GP2b-HA重組質(zhì)粒。參考GenBank中豬源核糖體蛋白基因L12堿基序列（AY550045.1），設(shè)計引物RPL12-F、RPL12-R（表1）。以Marc-145細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用RPL12引物擴增基因片段，擴增片段產(chǎn)物和pCAGGS載體經(jīng)EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切后膠回收，利用T4酶連接的方法將RPL12基因片段克隆到pCAGGS載體中，構(gòu)建N端帶有FLAG標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pCAGGS-RPL12-FLAG。

通過RNA提取試劑盒提取PRRSV總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以PRRSV-GP2b-F、PRRSV-GP2b-R引物擴增GP2b基因片段，Kpn I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切GP2b片段和pCAGGS載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，確定其大小后紫外燈下切割目的片段，然后回收。用T4 DNA連接酶將GP2b目的片段及pCAGGS載體片段37 ℃連接2 h，連接產(chǎn)物在Trans 5 α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選克隆，構(gòu)建N端帶有HA標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pCAGGS-GP2b-HA。以上重組質(zhì)粒分別進行雙酶切和測序驗證。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Marc-145細(xì)胞按1∶3比例傳代，每孔500 μl細(xì)胞懸液滴加到24孔細(xì)胞板中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 3000操作說明轉(zhuǎn)染pCAGGS-RPL12-FLAG重組質(zhì)粒，同時轉(zhuǎn)染pCAGGS空載體作為對照，具體步驟如下：分別在2個無菌EP管中加入250 μl Opti-MEM，1個加入2 μl Lip3000，另1個加入2 μl P3000和1 μg質(zhì)粒，分別室溫孵育5 min后，將Lip3000混合液滴加到p3000混合液中，室溫孵育10 min，將孵育完成后的混合物逐滴加入到培養(yǎng)板，最后輕輕晃動培養(yǎng)板混勻培養(yǎng)基，在37 ℃ 、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，收取細(xì)胞進行檢測。

1.2.3 si-RNA轉(zhuǎn)染 Marc-145細(xì)胞密度達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 3000操作說明轉(zhuǎn)染si-RNA，具體步驟如下：取無菌EP管，加入3 μl的轉(zhuǎn)染試劑Lip3000與50 nmol/L的si-RNA，加入Opti-MEM補至50 μl。同時轉(zhuǎn)染50 nmol/L的si-NC作為對照。用移液槍輕輕混勻，室溫孵育10 min，將轉(zhuǎn)染混合液逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，最后輕輕晃動培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，收取細(xì)胞進行檢測。

1.2.4 病毒接種與病毒滴度檢測 質(zhì)?；騭i-RNA轉(zhuǎn)染24 h后，將PRRSV（MOI=0.1）接種至Marc-145細(xì)胞中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，棄去病毒液，用無菌PBS再次清洗細(xì)胞后加入2%血清DMEM維持液。病毒接種36 h后收取細(xì)胞，細(xì)胞反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片，取上清液-80 ℃保存。將Marc-145細(xì)胞接種到96孔板，當(dāng)細(xì)胞長成單層后，用無血清DMEM 1∶10稀釋PRRSV病毒液，每個稀釋濃度8次重復(fù)，每孔150 μl病毒液，接種到細(xì)胞中，在37 ℃體積分?jǐn)?shù)的5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d以上，逐日觀察病變，記錄病變孔數(shù)，按照Reed-Muench方法計算病毒TCID50。

1.2.5 Western-blotting檢測 將Marc-145細(xì)胞用蛋白裂解液裂解，加入1×SDS loading buffer金屬浴100 ℃煮沸10 min，充分裂解細(xì)胞獲取蛋白質(zhì)樣品。每孔加入10 μl細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)，經(jīng)12.5%硫酸十二烷基鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育2 h，1×PBST洗膜3次，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜3次，HRP標(biāo)記二抗在室溫孵育1 h，洗膜3次，利用ECL曝光系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測 按照Hipure Total RNA MiNi Kit總RNA小提試劑盒收集細(xì)胞并提取細(xì)胞中的總RNA，參照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板進行擴增，PCR反應(yīng)總體系為20.0 μl，10.0 μl 2×AceQ qPCR Probe Master Mix，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物，0.2 μl 10 μmol/L Taq man Probe，0.4 μl 50×ROX Reference Dye，1.0 μl cDNA，7.6 μl水。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。進行PRRSV拷貝數(shù)的Real-time RT-PCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行病毒拷貝數(shù)的絕對熒光定量計算，所有處理組均重復(fù)檢測3次，擴增引物見表1。TanMan探針序列為5′-FAM TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-3′。

1.2.7 激光共聚焦檢測 將Marc-145細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后均勻鋪于帶有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為70%時，pCAGGS-RPL12-FLAG和pCAGGS-GP2b-HA共轉(zhuǎn)染1 μg，同時將2種質(zhì)粒分別和空載體共轉(zhuǎn)染1 μg，并設(shè)立不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞孔為陰性對照，轉(zhuǎn)染36 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，用預(yù)冷的80%乙醇溶液4 ℃固定細(xì)胞30 min，棄掉固定液，PBS洗3次，Mouse-Anti-FLAG按照1∶1 000（體積比）稀釋，，Rabbit-Anti-HA按照1∶500（體積比）稀釋，混合后滴加到細(xì)胞孔中，在恒溫孵育箱中37 ℃孵育2 h，PBS清洗細(xì)胞3次，使用FITC-熒光二抗（1∶400）37 ℃孵育1 h，PBS清洗細(xì)胞3次，用DAPI核染料染色5 min，PBS清洗細(xì)胞3次，取出爬片，用固封液將爬片固定在載玻片上，放置在暗處晾干，使用Zessi激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.8 Co-IP檢測 pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS-GP2b-HA重組質(zhì)粒在細(xì)胞匯合率達到約70%的24孔Marc-145細(xì)胞板中共轉(zhuǎn)染1 μg，pCAGGS-RPL12-FLAG、pCAGGS空載體共轉(zhuǎn)染1 μg。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h后，每孔加入70 μl蛋白質(zhì)裂解液收集細(xì)胞，5 000 r/min離心5 min以去除細(xì)胞碎片，取100 μl上清液加入SDS buffer煮沸為對照組，其余上清液與anti-HA抗體（1～1 000）4 ℃輕搖孵育過夜，再與protein A+G Agarose 4 ℃緩慢搖動偶聯(lián)4 h。免疫復(fù)合物被沉淀，采用Western blotting檢測結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用t檢驗法統(tǒng)計各組標(biāo)準(zhǔn)差及組間差異顯著性。P<0.05時差異顯著，標(biāo)記為*，P<0.01時差異極顯著，標(biāo)記為**。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV感染促進Marc-145細(xì)胞中RPL12的表達

為了檢測PRRSV感染對細(xì)胞內(nèi)RPL12表達的影響，將PRRSV（MOI=0.1）接種到Marc-145細(xì)胞，分別于感染后12 h、24 h和36 h收集細(xì)胞，通過熒光定量和Western-blotting方法檢測內(nèi)源基因RPL12表達的變化，結(jié)果顯示，隨著PRRSV的復(fù)制，RPL12的轉(zhuǎn)錄水平（圖1A）和蛋白質(zhì)表達水平（圖1B）均明顯增強，說明PRRSV感染能夠上調(diào)細(xì)胞中RPL12的表達。

2.2 過表達RPL12促進PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制

將pCAGGS-RPL12-FLAG重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞密度達到70%的Marc-145細(xì)胞中，24孔Marc-145細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒作為對照，轉(zhuǎn)染24 h后將PRRSV（MOI=0.1）接種到Marc-145細(xì)胞后，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，分別在接種病毒后1 h、12 h、24 h、36 h收取細(xì)胞，用Western-blotting和熒光定量PCR方法檢測病毒含量，結(jié)果顯示，PRRSV感染后12 h、24 h、36 h，過表達RPL12對PRRSV復(fù)制都有促進作用（圖2A）（P<0.01）。感染后36 h的細(xì)胞中PRRSV的蛋白質(zhì)含量（圖2B）和病毒滴度（圖2C）均極顯著增加（P<0.01）。這些結(jié)果說明過表達RPL12對PRRSV的增殖有促進作用。

2.3 敲減RPL12抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制

轉(zhuǎn)染干擾片段24 h后，將PRRSV（MOI=0.1）接種到Marc-145細(xì)胞中，分別在1 h、 12 h、24 h、36 h后收取細(xì)胞樣品，提取并反轉(zhuǎn)錄500 ng RNA作為模板，利用熒光定量方法檢測PRRSV N基因的變化，結(jié)果顯示，PRRSV感染后的12 h、24 h、36 h，敲減RPL12對PRRSV復(fù)制都有抑制作用（圖3A）（P<0.05或 P<0.01）。同樣的，36 h收取的細(xì)胞中PRRSV的N蛋白含量（圖3B）、病毒拷貝數(shù)（圖3C）均降低。這些結(jié)果說明敲減RPL12會抑制PRRSV的增殖。

2.4 RPL12蛋白與PRRSV GP2b蛋白的相互作用

為了驗證RPL12與GP2b之間的相互作用，將pCAGGS-RPL12-FLAG 和pCAGGS-GP2b-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞，并設(shè)置空載體共轉(zhuǎn)染組作為對照。轉(zhuǎn)染30 h后用RIPA蛋白裂解液收取細(xì)胞進行co-IP分析。12 000 r/min離心5 min去除細(xì)胞碎片，取離心后的上清液加入鼠抗HA單克隆抗體置于側(cè)擺搖床上4 ℃孵育過夜，再加入 protein（A+G） 瓊脂糖凝珠偶聯(lián)4 h，洗滌后收取樣品進行蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果表明，RPL12與PRRSV GP2b蛋白存在相互作用（圖4）。

2.5 RPL12蛋白與PRRSV GP2b蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)

為了進一步驗證RPL12與PRRSV GP2b蛋白的相互作用，將pCAGGS-RPL12-FLAG和pCAGGS-GP2b-HA重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞36 h后，進行細(xì)胞固定，洗滌3次后，共孵育Flag和HA抗體，不同熒光標(biāo)記二抗孵育后，利用激光共聚焦檢測RPL12與PRRSV GP2b在Marc-145細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示，RPL12在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有定位，GP2b主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)RPL12與GP2b共表達時，兩者在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位（圖5）。

3 討論

2006年至今，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在中國大部分地區(qū)持續(xù)蔓延[18]，是影響中國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)最嚴(yán)重的病毒之一[19]。近些年，PRRSV類NADC30毒株迅速在中國大部分地區(qū)流行。由于PRRSV具有抗原變異[20-21]、抗體依賴性增強、免疫抑制[22-23]以及在豬群中常持續(xù)性感染等特點，PRRSV的防控及根除具有較大難度。目前對PRRSV感染與復(fù)制機制了解甚少，對病毒的一些功能蛋白的解析也很有限，宿主蛋白在PRRSV復(fù)制中的作用研究也不深入，這些問題均需要進一步研究，以便闡明PRRSV感染與復(fù)制機制，為PRRSV防控措施的制定提供理論依據(jù)。

宿主蛋白在病毒感染與復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多個抗病毒蛋白質(zhì)，例如干擾素（IFN）誘導(dǎo)的先天性免疫抑制因子（Myxovirus resistance 2， Mx2）[24]，干擾素（IFN）刺激蛋白Viperin[25]，干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列3 （IFIT3）[26]，膽固醇25-羥化酶（CH25H）[27]等。而有關(guān)促進病毒復(fù)制的宿主蛋白報道較少見。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了宿主蛋白RPL12能夠促進PRRSV的復(fù)制。RPL12屬于核糖體蛋白L11P家族，RPL12基本上通過調(diào)控自身的剪接來調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄，RPL12缺失以密碼子特異性的方式影響翻譯[28-29]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RPL12能夠與GP2b蛋白互作，這可能是其促進PRRSV復(fù)制的重要原因之一，而其中的具體機制還有待進一步探索。

GP2b蛋白是一種非糖基化的膜蛋白，其相對分子質(zhì)量為10 000[30]，被認(rèn)為參與病毒的侵入[31]和復(fù)制[32]。GP2b蛋白在2種類型PRRSV中高度保守且相對大量地存在于病毒粒子中，GP2b與GP3、GP4結(jié)合形成病毒粒子表面的異三聚體復(fù)合物，在介導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫、維持病毒糖蛋白間的正確構(gòu)象及病毒的感染等方面發(fā)揮重要的作用[33]。病毒蛋白與宿主蛋白互作的相關(guān)研究對于研究PRRSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及逃避宿主及宿主抵抗病毒感染的方式都有著非常重要的意義。在細(xì)胞水平上研究PRRSV與其宿主蛋白互作的機制有利于尋找更加保守、廣譜的靶點。RPL12基因編碼核糖體的結(jié)構(gòu)蛋白，并參與蛋白質(zhì)翻譯[34]與蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)[35]，本研究前期構(gòu)建了豬肺泡巨噬細(xì)胞的酵母雙雜交cDNA文庫，成功地構(gòu)建了PGBKT7-2b釣餌載體和釣餌菌株，篩選出與GP2b互作的RPL12。本研究中發(fā)現(xiàn)宿主蛋白RPL12能夠與GP2b互作，并促進PRRSV復(fù)制，進一步擴展了GP2b的蛋白質(zhì)功能。由此可見，GP2b不但在病毒的組裝中發(fā)揮重要功能，其在病毒和宿主互作過程中也發(fā)揮作用。因此，GP2b有可能成為防控PRRSV的靶點之一。

本研究通過免疫共沉淀、激光共聚焦試驗發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞核糖體蛋白L12 （RPL12）與PRRSV GP2b蛋白之間的相互作用。另外，隨著PRRSV的復(fù)制，RPL12的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平均明顯增強，PRRSV感染能夠上調(diào)細(xì)胞中RPL12的表達。同時，熒光定量和Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)過表達RPL12能夠促進PRRSV的復(fù)制，敲減RPL12能夠抑制PRRSV的復(fù)制。通過上述研究結(jié)果擴展了PRRSV GP2b的蛋白質(zhì)功能，有助于進一步研究PRRSV的感染與復(fù)制機制以及與宿主之間的相互作用。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）