內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡在牙周炎促血管鈣化中的作用

宋欣 陳艷青 李靜 潘克清

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，山東 青島 266003；2 青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院； 3 廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院廈門市婦幼保健院口腔科)

血管鈣化是軟組織在慢性炎癥刺激下發(fā)生的類似于骨化過程的病理表現(xiàn)，是心血管系統(tǒng)疾病的獨立危險因素[1]。細胞凋亡可引發(fā)血管平滑肌細胞鈣化，而且在血管鈣化的進程中廣泛存在[2-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是介導(dǎo)細胞凋亡的信號通路之一，并參與了血管鈣化的過程[4]。可溶性蛋白和膜蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行合成和加工，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到刺激時，未正確折疊的蛋白質(zhì)會發(fā)生積聚，從而引發(fā)ERS。輕度的ERS可產(chǎn)生保護細胞、減緩細胞損傷的作用，但是ERS超負荷時，則會啟動細胞凋亡程序[5]。牙周炎是一種以牙菌斑微生物為始動因子的牙周組織的慢性炎癥，是心腦血管病、糖尿病、慢性腎病和呼吸功能減退等的危險因素之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎對血管鈣化具有一定的促進作用[7-8]。本研究旨在探討ERS介導(dǎo)的細胞凋亡是否參與了牙周炎促血管鈣化的過程，及其參與的具體機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

雄性Wistar大鼠40只[許可證號：SCXK(魯)20130001]，8周齡，體質(zhì)量(180±20)g，由青島大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗中心提供。40只大鼠隨機分為4組，牙周炎組(CP組)、血管鈣化組(VDN組)、牙周炎+血管鈣化組(CP+VDN組)、對照組(C組)，每組10只大鼠。

1.2 藥品與試劑

維生素D3購自上海通用制藥有限公司；尼古丁購自美國Sigma公司；兔抗大鼠半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗體、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)多克隆抗體、兔抗大鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)多克隆抗體、兔抗大鼠c-Jun氨基端激酶(JNK)多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗體購買自北京Bioss公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購買自于武漢Boster公司；BHI液體培養(yǎng)基購買自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 各組的處理

CP組大鼠僅在實驗第1天于左、右上頜第二磨牙牙頸部的齦溝內(nèi)結(jié)扎4-0絲線，然后每周1次于牙齦緣接種牙周混合致病菌菌懸液(參照孟蕓等[8]報道的方法由BHI液體培養(yǎng)基配置而成)0.1 mL，至實驗結(jié)束；VDN組大鼠僅在實驗第1天9:00肌肉內(nèi)注射維生素D33×105U/kg 1次，將尼古丁(25 mg/kg)溶于花生油(5 mL/kg)中分別于9:00和18:00各灌胃1次；CP+VDN組大鼠先按照CP組的方法進行處理后，再按照VDN組方法進行處理；C組大鼠牙頸部的齦溝內(nèi)沒有結(jié)扎絲線，僅每周1次于左、右上頜第二磨牙齦緣接種0.1 mL生理鹽水，同時在實驗第1天9:00肌肉注射與維生素D3等體積的生理鹽水，并于9:00和18:00灌胃花生油各1次。所有大鼠均在相同環(huán)境下常規(guī)喂飼8周后，全麻處死，取出大鼠的主動脈血管，固定、石蠟包埋，常規(guī)制作石蠟切片。本研究經(jīng)青島大學(xué)動物研究委員會批準(zhǔn)[編號：AHQU20140425]，所有動物的處理均符合倫理要求。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)和免疫組織化學(xué)染色觀察

將每組的組織切片隨機分為兩部分，一部分進行HE染色：使用常規(guī)脫蠟方法將石蠟切片脫蠟，進行蘇木精染色，用水漂洗后進行伊紅染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。另一部分經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，進行免疫組化染色：將相對應(yīng)的陽性染色片作為陽性對照(Caspase-3為兔肝臟組織，GRP78為人結(jié)腸癌組織，CHOP為人腦組織，JNK為人結(jié)腸組織，Caspase-12為兔心臟組織)，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。滴加H2O2溶液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3 min，共3次。微波修復(fù)抗原，PBS洗滌；滴加BSA封閉液，37 ℃作用30 min；滴加Ⅰ抗(1∶50稀釋)，37 ℃作用2 h后，PBS洗滌；加入Ⅱ抗，37 ℃作用30 min后，PBS洗滌；加入SABC，37 ℃作用30 min，PBS洗滌，以上步驟中的洗滌均為3次，每次5 min；加入DAB顯色劑，通過光鏡控制顯色時間，蘇木精染色1 min，梯度乙醇脫水，透明、封片，光鏡下觀察并拍片。以大鼠血管平滑肌細胞當(dāng)中出現(xiàn)棕褐色或者棕黃色顆粒作為Caspase-3、GRP78、CHOP、JNK及Caspase-12表達陽性。使用Image Pro Plus 6.0軟件處理免疫組化染色結(jié)果，每個切片隨機選擇3個視野，測定吸光度(A)值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠主動脈血管組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，C組大鼠的主動脈血管內(nèi)膜、中膜及外膜各層清晰完好(圖1A)；CP組大鼠主動脈血管內(nèi)膜相對完整，中外彈性膜顯示局部纖維層松散無序，出現(xiàn)破損(圖1B)；VDN組大鼠主動脈血管壁厚度增加，血管組織中彈性纖維組織結(jié)構(gòu)更加松散，平滑肌細胞增殖并呈無序排列(圖1C)；CP+VDN組大鼠主動脈血管壁明顯增厚，病變破壞可累及管壁全層，血管組織中彈性纖維排列疏松紊亂，主動脈平滑肌細胞壞死減少(圖1D)。

A：C組，B：CP組，C：VDN組，D：CP+VDN組，HE染色，400倍圖1 各組大鼠主動脈血管組織病理形態(tài)學(xué)觀察

2.2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，牙周炎和血管鈣化兩種因素對Caspase-3、GRP78及CHOP表達均具有顯著影響，并且對CHOP具有交互作用(F=585.53～1 157.70，F(xiàn)交互=14.76，P<0.05)。與C組相比，其他組大鼠血管組織中Caspase-3和GRP78的表達水平顯著升高(F=680.12、708.93，P<0.05)，CP+VDN組大鼠主動脈血管組織中Caspase-3和GRP78的表達高于其他組(P<0.05)。牙周炎和血管鈣化對JNK及Caspase-12表達無明顯影響(P>0.05)。對CHOP表達影響的單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示，當(dāng)血管鈣化因素不存在時，牙周炎因素則會導(dǎo)致CHOP表達升高(F=200.20，P<0.05)；當(dāng)血管鈣化因素存在時，牙周炎因素會導(dǎo)致CHOP的表達進一步升高(F=407.30，P<0.05)；當(dāng)牙周炎因素不存在時，血管鈣化因素會使CHOP表達升高(F=276.69，P<0.05)；當(dāng)牙周炎因素存在時，血管鈣化因素會導(dǎo)致CHOP的表達進一步升高(F=436.96，P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 各組大鼠血管組織中各蛋白的表達(Envision，400倍)

表1 各組大鼠中各項因子的表達

3 討 論

牙周炎是牙周組織的慢性感染性疾病，與體內(nèi)多種全身疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。血管鈣化是一種可由慢性炎癥引起的異常鈣質(zhì)沉積，是血管病變中的常見表現(xiàn)[10]。流行病學(xué)研究顯示，牙周炎和血管鈣化間呈顯著正相關(guān)[11-12]。本研究采用齦溝內(nèi)絲線結(jié)扎合并牙齦接種牙周致病菌的方法建立大鼠牙周炎模型，HE染色結(jié)果顯示，大鼠主動脈血管壁中外彈性膜局部纖維層疏松、斷裂，提示牙周炎可能會引起血管壁結(jié)構(gòu)損傷，對血管鈣化具有一定的促進作用。

細胞凋亡機制復(fù)雜多樣，涉及到一系列蛋白及蛋白酶的激活與調(diào)節(jié)。Caspase-3屬于凋亡效應(yīng)因子，參與下游特異性底物的裂解，是細胞凋亡過程中最關(guān)鍵的一種因子，一旦被激活，則細胞凋亡進程不可逆轉(zhuǎn)[13]。LUO等[14]報道Caspase-3是參與心血管平滑肌細胞凋亡的主要執(zhí)行者。當(dāng)血管平滑肌細胞發(fā)生凋亡時，凋亡小體會促進鈣鹽沉積，繼而啟動血管鈣化[15]。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Caspase-3在VDN組大鼠主動脈血管組織中的表達顯著高于C組，提示在血管鈣化過程中存在細胞凋亡情況；CP組大鼠主動脈血管組織中Caspase-3的表達比C組高，提示牙周炎可能會促使血管組織發(fā)生細胞凋亡；CP+VDN組大鼠主動脈血管組織中Caspase-3的表達最高，表明在牙周炎合并血管鈣化時，血管組織中的細胞凋亡程度明顯增加，提示細胞凋亡可能參與了牙周炎促血管鈣化的過程。

近年研究發(fā)現(xiàn)，ERS是介導(dǎo)細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑之一[16]，與心血管系統(tǒng)損傷的發(fā)生有關(guān)[17]。GRP78的上調(diào)是ERS被激發(fā)的重要標(biāo)志[18]。發(fā)生慢性牙周炎時，牙周袋內(nèi)的致病菌及其多種毒性因子可能通過受損的牙周組織進入血液循環(huán)中，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，影響主動脈壁血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的功能。KOZAROV等[19]報道在動脈粥樣硬化病變的組織中可檢測到活的牙周致病菌，LIU等[20]研究顯示牙齦卟啉單胞菌的毒性因子脂多糖可刺激血管平滑肌細胞，促進其成骨化及鈣化。炎癥刺激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡及氧化應(yīng)激可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白質(zhì)折疊異常，引起ERS，導(dǎo)致GRP78和GRP94表達上調(diào)，以減少蛋白質(zhì)合成并促進其正確加工和降解。當(dāng)ERS超負荷時，GRP78的表達量不足以穩(wěn)定蛋白質(zhì)折疊，細胞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)平衡發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞功能失調(diào)，并啟動細胞凋亡，進而參與了血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，GRP78在CP組、VDN組、CP+VDN組大鼠主動脈血管組織中的表達顯著高于C組，可能存在ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，其中，CP+VDN組大鼠主動脈血管組織中GRP78的表達水平最高，提示ERS介導(dǎo)的細胞凋亡可能是牙周炎促血管鈣化過程中的機制之一。

ERS可以通過Caspase-12、JNK通路以及CHOP/GADD153基因轉(zhuǎn)錄三種途徑介導(dǎo)細胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，牙周炎和血管鈣化兩因素對CHOP的表達有協(xié)同升高的作用，這提示ERS介導(dǎo)的細胞凋亡可能是通過CHOP通路參與了牙周炎促血管鈣化的進程。信號蛋白CHOP是ERS特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與ERS并介導(dǎo)細胞凋亡。在非應(yīng)激條件下，CHOP通常以較低的表達量存在于胞質(zhì)中，但當(dāng)ERS被激活時，CHOP的表達可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ類跨膜蛋白IRE1、PERK及Ⅱ類跨膜蛋白ATF6三條信號通路顯著增高，當(dāng)ERS過反應(yīng)時，BIM等促凋亡基因表達上調(diào)，Bcl-2等抗凋亡基因表達下調(diào)，從而介導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[22]。本研究中血管組織中JNK與Caspase-12微量表達，分析其原因，可能是由于發(fā)生ERS時，一部分活化的跨膜蛋白IRE1可以促使腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)從與Caspase12前體結(jié)合的復(fù)合體中解離，并與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上結(jié)合，同時激活了Caspase-12[23]。而IRE1-TRAF2復(fù)合體通過活化凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)，又引發(fā)了下游JNK的磷酸化，使此路徑被激活[24]。但析因分析結(jié)果顯示，牙周炎和血管鈣化因素對JNK和Caspase-12的表達無顯著影響，提示這兩種通路在牙周炎促血管鈣化的過程中可能并非主要途徑。

總之，本研究通過對各組大鼠主動脈血管組織進行免疫組化檢測，結(jié)果提示ERS介導(dǎo)的細胞凋亡可能參與了牙周炎促血管鈣化的過程，其機制可能與CHOP通路有關(guān)。本研究為今后進一步揭示牙周炎促血管鈣化的作用機制奠定了基礎(chǔ)，為研究全身系統(tǒng)性疾病的臨床防治提供了部分參考依據(jù)。