超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

楊宗玲，李 晗，范方宇，郭 磊，王振興，楊代勇，何曉雪，林仫發(fā)

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；3.云南省昆明市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，云南昆明 650224）

無籽刺梨（Rosa sterilisS.D.Shi）屬薔薇科薔薇屬多年生落葉攀緣類果樹，廣泛分布于亞熱帶及暖溫帶地區(qū)，我國主要分布在四川、貴州、云南等地，其成熟后表面果刺脫落，種子敗育，無果核或少許果核，故名無籽刺梨[1?4]。近年來，隨著刺梨產(chǎn)業(yè)越來越受國家和地方的重視，以貴州省為主的刺梨產(chǎn)量也逐年提高。目前，刺梨加工類食品主要有果脯、果酒、果醬、飲料、果奶、刺梨糕等。隨大量刺梨加工產(chǎn)品出現(xiàn)，其加工副產(chǎn)物—刺梨果渣也逐年上升。刺梨果渣約占果實(shí)質(zhì)量的50%[5]。初步估計(jì)僅貴州省每年產(chǎn)刺梨果渣達(dá)7500 噸以上[6]。為減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。刺梨果渣深加工的相關(guān)研究也相繼出現(xiàn)，如以刺梨果渣為原料提取膳食纖維[7]、多糖[8]、制備刺梨果渣超微粉[9]、發(fā)酵果醋[10]、生產(chǎn)飼料[11]等。

無籽刺梨果渣富含多種活性成分如超氧化物歧化酶、多酚、多糖、胡蘿卜素、三萜、苷類、維生素C、黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌、抗疲勞及延緩衰老等作用[12?14]。據(jù)報(bào)道，刺梨經(jīng)榨汁后80%以上的黃酮留在刺梨渣中[11]。王振偉等[15]利用超聲波輔助提取刺梨中黃酮，結(jié)果表明，超聲波輔助提取刺梨黃酮較常規(guī)回流提取法，黃酮得率被有效提高；李俠等[16]以綠豆皮為原料，比較了單獨(dú)超聲提取和酶法提取綠豆皮中總黃酮，結(jié)果表明，在相同超聲條件下，超聲波-酶法提取綠豆皮中黃酮類化合物得率提高了18.54%。采用超聲輔助酶法提取無籽刺梨中黃酮的研究鮮有報(bào)道。本文采用超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為無籽刺梨中黃酮的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無籽刺梨果渣 云南曲靖昆鋼金副食品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技公司；鹽酸 分析純，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）純度≥99.5%，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、抗壞血酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、水楊酸、過氧化氫 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；纖維素酶（CAS 9012-54-8） 酶活力≥35U/mg（BR級別），南京都南生物公司；DPPH（96%）、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚 分析純，上海麥克林生化科技有限公布公司；七水合硫酸亞鐵 分析純，廣東光華科技股份有限公司。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BJ-800A粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；DT-1 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器公司；DK-98-2 恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SB25-12DTDS超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)日本島津公司；Sigma3K15 離心機(jī) 德國西格瑪離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無籽刺梨果渣中總黃酮提取研究

1.2.1.1 無籽刺梨果渣處理 采用60 ℃烘箱干燥無籽刺梨果渣24 h，粉碎，過60 目篩，儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.1.2 無籽刺梨果渣中黃酮提取工藝 準(zhǔn)確稱量2.00 g無籽刺梨果渣粉，按設(shè)定液料比加入所需濃度的乙醇，用1 mol/L NaOH和10%醋酸調(diào)節(jié)pH為4.5（纖維素酶酶解適宜pH），設(shè)置超聲參數(shù)（超聲溫度為60 ℃）進(jìn)行超聲提取，超聲提取結(jié)束后，按底物濃度加入設(shè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，于水浴鍋中50 ℃水浴酶解，酶解結(jié)束后，于90～95 ℃水浴滅酶5 min，5500 r/min于離心機(jī)中離心10 min。取上清液用相應(yīng)提取濃度的溶劑于容量瓶中定容至100 mL得黃酮粗提取液。

1.2.1.3 黃酮含量測定 參考劉暢等[17]的方法，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸直線方程為y=12.962x?0.014，R2=0.99924。取1 mL1.2.1.2 中制備的黃酮粗提液于25 mL的容量瓶中，用相應(yīng)提取濃度的乙醇定容使其稀釋25 倍，再于稀釋液中取1 mL于10 mL容量瓶中。按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法加入相應(yīng)試劑顯色后于510 nm處測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮濃度，采用式（1）計(jì)算黃酮得率。

式中：10 為1 mL稀釋液加試劑顯色后的總體積，mL；C為1 mL稀釋液加試劑顯色后溶液中黃酮的濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)，25；100 為黃酮粗提液體積，mL；m為無籽刺梨果渣粉質(zhì)量，g。

1.2.1.4 無籽刺梨果渣黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn) 以液料比30 mL/g、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間40 min、超聲功率250 W、酶解時(shí)間40 min、加酶量0.2%為基本條件，改變液料比（10、20、30、40、50 mL/g）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時(shí)間（30、40、50、60、70 min）、超聲功率（150、200、250、300、350 W）、酶解時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、加酶量（0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）六個因素條件，考察各個因素對超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮得率的影響。

1.2.1.5 無籽刺梨果渣黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮得率的主要因素液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和加酶量作為自變量，無籽刺梨果渣中黃酮得率為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1中Box-Behnken試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)。因素及水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.2 無籽刺梨果渣黃酮純度計(jì)算 將優(yōu)化工藝條件下制備的無籽刺梨果渣黃酮粗提液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏，冷凍干燥，稱取4.40 mg黃酮粗提物，用55%乙醇溶解并定容至25 mL作為待測液，取1 mL待測樣液按1.2.1.3 中的方法計(jì)算待測液中的黃酮含量。黃酮純度采用式（2）計(jì)算。本研究提取無籽刺梨果渣黃酮純度為25.5%。

式中M1為待測樣液中黃酮含量，mg；M2為黃酮粗提物質(zhì)量，mg。

1.2.3 無籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性研究 無籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性強(qiáng)弱以樣品清除率為50%時(shí)所對應(yīng)的濃度（EC50，mg/mL）來判斷，EC50值越低表示抗氧化性越強(qiáng)。EC50采用Origin 8.0 回歸分析計(jì)算。

1.2.3.1 DPPH·清除率測定 參照譚欽鐸[18]的方法，將1.2.1 部分中超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮優(yōu)化工藝參數(shù)為提取條件提取黃酮，所得黃酮粗提液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏，然后冷凍干燥。凍干粉采用55%的乙醇復(fù)溶，配制黃酮濃度為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1 mg/mL，取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品液于試管中加入0.08 mg/mL的DPPH溶液，采用漩渦震蕩儀混勻，避光反應(yīng)30 min后，測定在517 nm處樣品的吸光度值（A0）；取2 mL不同濃度的樣品液于試管中，加入2 mL無水乙醇作為對照組，測定在517 nm處的吸光度值（A1）；以2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液反應(yīng)設(shè)置空白組，測定在517 nm處的吸光度值（A2）。以同濃度的VC為對照。DPPH·清除率采用式（3）計(jì)算。

抗逆力(resilience，又被翻譯為“復(fù)原力”、“心理韌性”等)是個人面對生活逆境時(shí)，能夠理性做出正向的、建設(shè)性的選擇方法和應(yīng)對策略的能力③?？鼓媪κ?0 世紀(jì)50 年代以來歐美各國心理學(xué)領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)問題?？鼓媪碚撝鲝垙姆e極心理學(xué)視角挖掘個人的內(nèi)在潛能，不再單純關(guān)注問題的負(fù)面影響，而是強(qiáng)調(diào)人在面對壓力、逆境時(shí)的潛能激發(fā)和自我超越④。

1.2.3.2 ·OH清除率測定 參考張倩茹[19]的方法，配制無籽刺梨果渣黃酮濃度為分別0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL，于試管中依次加入1.0 mL樣液、1.0 mLFeSO4（9.0 mol/L）、1.0 mLH2O2（8.8 mmol/L），采用漩渦震蕩儀混勻，室溫反應(yīng)10 min，再加入1.0 mL水楊酸乙醇溶液（9.0 mmol/L），室溫靜置反應(yīng)30 min，5000 r/min于離心機(jī)中離心5 min，取上清液測定510 nm處吸光度值為A0。取相同濃度的VC為對照。·OH清除率采用式（4）計(jì)算。

式中：A1為蒸餾水代替FeSO4吸光度值；A2為55%乙醇代替樣液吸光度值。

式中：A0為樣液和鄰苯三酚的吸光度值；A1為不加鄰苯三酚添加樣品的吸光度值；A2為添加鄰苯三酚不加樣品的吸光值。

1.2.3.4 還原力測定 參照孟娜等[21]的方法，利用鐵氰化鉀還原法，樣品還原力的強(qiáng)弱通過測定吸光度值判斷，吸光度值越大，還原力越強(qiáng)。具體方法為：配制無籽刺梨果渣黃酮濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，于試管中依次加入2.5 mL樣液、2.5 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）、2.5 mL1%鐵氰化鉀水溶液，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸水溶液2.5 mL，離心（3000 r/min，10 min），依次取5.0 mL上清液、4.0 mL蒸餾水、1.0 mL0.1%三氯化鐵水溶液混合均勻，測定700 nm處吸光度值。取相同濃度的VC為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上處理均做3 次平行實(shí)驗(yàn)，圖表中數(shù)據(jù)為3 次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，軟件IBM SPSS Statistics 20 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，軟件Origin 8.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對無籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖1 可知，在液料比10～30 mL/g范圍內(nèi)，黃酮得率隨液料比增大呈顯著（P<0.05）上升趨勢；液料比40 mL/g時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為83.45 mg/g；繼續(xù)提高液料比黃酮得率差異不顯著（P>0.05）。原因?yàn)橐毫媳冗^低，原料與提取溶劑接觸不充分，黃酮未被有效溶出；增大液料比，原料被充分浸沒在提取溶劑中，在超聲波作用下黃酮被充分溶出，得率提高；液料比過大時(shí)，體系中的可溶性物質(zhì)會與黃酮競爭溶劑，影響黃酮提取，另外，過高的液料比會使超聲波的能量過多消耗在溶劑上，而原料吸收的能量較低，黃酮得率下降[22]。本文選擇液料比水平30、40、50 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 液料比對黃酮提取的影響Fig.1 Effect of liquid-material radio on the extraction of flavonoids

2.1.2 乙醇濃度對無籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖2 可知，在乙醇濃度30%～60%范圍內(nèi)，黃酮得率隨乙醇濃度升高逐漸增加，黃酮得率在乙醇濃度60%時(shí)達(dá)到最大，為83.45 mg/g，繼續(xù)增大乙醇濃度，黃酮得率呈顯著（P<0.05）下降趨勢。主要原因?yàn)橐掖紳舛鹊母叩椭苯佑绊懠?xì)胞內(nèi)外的濃度差，濃度差越大越有利于黃酮浸出，黃酮得率提高[22]；但乙醇濃度過高時(shí)，體系中一些脂溶性物質(zhì)增多與黃酮競爭性地浸出，另外，乙醇濃度過高會使纖維素酶活性降低，導(dǎo)致黃酮得率下降[23]。本文選乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of flavonoids

圖3 超聲時(shí)間對黃酮提取的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of flavonoids

2.1.4 超聲功率對無籽刺梨果渣黃酮提取的影響圖4 可知，在150～300 W的超聲功率范圍內(nèi)，隨超聲功率的增大，黃酮得率逐漸增加，超聲功率300 W時(shí)黃酮得率達(dá)到最大，為83.77 mg/g；當(dāng)超聲功率大于300 W時(shí)，黃酮得率顯著（P<0.05）降低。原因?yàn)槌暪β瘦^弱產(chǎn)生的機(jī)械及空化效應(yīng)對細(xì)胞壁的破壞程度小，黃酮得率低；而較強(qiáng)的超聲功率產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械波動效應(yīng)可增強(qiáng)細(xì)胞壁破壞的作用，提高黃酮得率；功率過大，超聲熱效應(yīng)產(chǎn)生大量熱量使活性成分結(jié)構(gòu)破壞，也有學(xué)者認(rèn)為較高的超聲功率產(chǎn)生強(qiáng)大的機(jī)械振動作用，使提取劑流動加快導(dǎo)致超聲波的停留時(shí)間減小，同時(shí)空化作用增強(qiáng)后產(chǎn)生的大量無用空化泡會增加超聲波的散射衰減，得率降低[26]。因此，超聲功率選擇300 W為宜。

圖4 超聲功率對黃酮提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of flavonoids

2.1.5 酶解時(shí)間對無籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖5 可知，黃酮得率在酶解時(shí)間20～40 min內(nèi)隨酶解時(shí)間的增大逐漸增大，40 min時(shí)達(dá)到最大值，為81.84 mg/g；當(dāng)酶解時(shí)間超過40 min，黃酮得率顯著（P<0.05）下降。原因?yàn)槊附鈺r(shí)間過短，纖維素酶對細(xì)胞壁的破碎不完全，黃酮未被有效提?。浑S酶解時(shí)間延長，細(xì)胞壁被充分破碎，黃酮被有效釋放，黃酮得率增加；酶解時(shí)間過長，底物濃度不斷降低或產(chǎn)物的積累對酶的活性有反饋抑制作用，酶促反應(yīng)降低，黃酮得率降低[27]。因此，酶解時(shí)間選擇40 min為宜。

圖5 酶解時(shí)間對黃酮提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on extraction of flavonoids

2.1.6 加酶量對無籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖6 可知，在加酶量0.0%～0.2%范圍，隨著加酶量的增加，黃酮得率逐漸增加，0.2%時(shí)黃酮得率最大，為84.09 mg/g，當(dāng)加酶量大于0.2%，黃酮得率隨加酶量的增加顯著（P<0.05）減少。原因?yàn)樘砑永w維素酶可將纖維素水解成水溶性糖，使細(xì)胞壁水解破裂增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)黃酮向主體溶劑中擴(kuò)散，提高黃酮得率[26]。然而，過量的酶添加量會使大量的酶附著在無籽刺梨果渣粉表面，堵塞黃酮的溶出通道，影響黃酮化合物的溶出，黃酮得率降低[28]。因此，選擇加酶量0.1%、0.2%、0.3%三個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖6 加酶量對黃酮提取的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on extraction of flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及回歸模型方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇因素液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、加酶量（D）為考察對象，無籽刺梨果渣粉中黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 對無籽刺梨果渣粉中黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，表2 為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。通過回歸擬合得液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和加酶量分析模型的二次多元回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and result of response surface methodology

Y=86.28+2.38A?4.37B?0.27C+1.97D?0.38AB?2.33AC?3.75AD?0.38BC?0.59BD?6.41CD?5.67A2?4.80B2?4.82C2?6.36D2

表3 為對回歸方程進(jìn)行方差分析的結(jié)果。由表3可知，模型中F=17.84，P<0.0001，模型差異極顯著，方程與實(shí)際情況擬合良好，能反應(yīng)黃酮得率與各因素之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)F=1.79，失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.2702>0.05），表明模型與試驗(yàn)因素?cái)M合較好，可用該模型和方程優(yōu)化無籽刺梨中黃酮的提取工藝。決定系數(shù)R2為0.9434，在響應(yīng)面方差分析中，該值越大，表明實(shí)際值與模型預(yù)測值之間的相關(guān)性越高。各因素對黃酮得率的影響可用F值判斷，F(xiàn)值越大，影響作用越強(qiáng)[29?30]。模型結(jié)果表明，因素液料比、乙醇濃度和加酶量對無籽刺梨果渣中黃酮得率影響均顯著（P<0.05），影響無籽刺梨果渣中黃酮提取的因素順序?yàn)椋阂掖紳舛?液料比>加酶量>超聲時(shí)間。交互因素AD、CD以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均顯著（P<0.05）。變異系數(shù)（C.V.）值越小，試驗(yàn)可靠性越高，本試驗(yàn)中C.V.=2.85%，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。精密度=12.907>4，表明試驗(yàn)可靠。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

2.2.2 因素交互作用 響應(yīng)面圖形是通過Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元二次回歸模型所作三維空間（3D）的曲面圖。在其他試驗(yàn)因素固定不變情況下，考察交互項(xiàng)對響應(yīng)值的影響，其可直觀反應(yīng)因素間的交互作用。各因素對無籽刺梨果渣中黃酮得率影響的大小可通過響應(yīng)面3D圖曲面圖陡峭程度判斷，曲面越陡峭，影響越大，反之則越小。圖7 為各因素交互作用對黃酮得率影響的3D圖曲面圖，交互作用項(xiàng)液料比和加酶量與交互作用項(xiàng)加酶量和超聲時(shí)間的3D圖曲面較其它交互作用項(xiàng)更陡峭，表明兩組交互作用項(xiàng)對無籽刺梨果渣中黃酮得率的影響均顯著，這與表3 方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)表3 的分析結(jié)果，各交互因素對無籽刺梨果渣中黃酮得率影響程度排序?yàn)椋篊D>AD>AC>BD>AB=BC。研究建立的模型具有最大值，根據(jù)模型擬合的結(jié)果，酶-超聲提取無籽刺梨果渣中黃酮較優(yōu)提取工藝為液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、加酶量0.2%，在此條件下黃酮的得率預(yù)測值為87.78 mg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果是否可靠，根據(jù)得到的優(yōu)化條件選擇液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、加酶量0.2%提取無籽刺梨果渣中的黃酮，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，提取黃酮得率為87.52 mg/g，此結(jié)果與模型預(yù)測值相差0.26 mg/g，模型重復(fù)性較好，基于響應(yīng)面試驗(yàn)所得優(yōu)化工藝參數(shù)具有可靠性。

圖7 各因素交互作用對黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Surface graph of the effect of interaction on the yield of flavonoids

2.3 無籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH·能力 圖8 為無籽刺梨果渣黃酮和VC對DPPH·清除率，由圖8 可知，在濃度0.005～0.02 mg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH·清除率隨濃度升高顯著（P<0.05）上升（43%～96%），當(dāng)VC濃度大于0.02 mg/mL后，VC對DPPH·的清除率維持在95%～96%，各濃度間清除率無顯著差異（P>0.05）。VC對DPPH·清除率EC50值為0.00628 mg/mL；在濃度0.005～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，無籽刺梨果渣黃酮對DPPH·清除率顯著（P<0.05）上升（18%～92%），當(dāng)濃度大于0.05 mg/mL，黃酮對DPPH·的清除率為93%～94%，各濃度間清除率無顯著差異（P>0.05），其對DPPH·的EC50值為0.0139 mg/mL，該值小于10 mg/mL，表明無籽刺梨果渣中黃酮有較好的抗氧化活性。周藝等[31]研究刺梨茶中總黃酮對DPPH·清除率EC50為0.01227 mg/mL，結(jié)合本試驗(yàn)，刺梨果渣中黃酮對DPPH·清除率略低于刺梨茶中黃酮，原因?yàn)樵诖汤娼?jīng)加工成果渣過程，活性物質(zhì)受不同程度損傷，抗氧化活性降低。

2.3.2 清除·OH能力 ·OH是對生物體危害最大的一種自由基，能使蛋白質(zhì)、核酸、糖類等物質(zhì)發(fā)化生氧化和損傷，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變，與衰老、腫瘤和細(xì)胞吞噬等作用有密切聯(lián)系[32]。圖9 為無籽刺梨果渣黃酮和VC對·OH清除率，由圖9 可知，隨濃度增加，黃酮粗提物和VC對·OH清除率均呈顯著（P<0.05）上升趨勢，在濃度0.05～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，無籽刺梨果渣黃酮對·OH的清除率高于VC；在濃度0.8～1.6 mg/mL范圍內(nèi)，無籽刺梨果渣黃酮對·OH的清除能力略低于VC。無籽刺梨果渣黃酮對·OH清除率的EC50值為0.30788 mg/mL，VC對·OH清除率的EC50值為0.32076 mg/mL，根據(jù)EC50，無籽刺梨果渣黃酮對·OH的清除率略高于VC。

圖10 無籽刺梨果渣黃酮和VC對清除率Fig.10 Scavenging effect of flavonoids from Rosa sterilis pomace and VC on

2.3.4 還原力 具有還原力的物質(zhì)能夠?qū)e3＋還原為Fe2＋，F(xiàn)e2＋再與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，生成物在700 nm波長處有最大吸光度，因而700 nm波長處吸光度大小反映了總還原力的強(qiáng)弱，吸光度越大，則樣品還原力越強(qiáng)[32,34]。圖11 為無籽刺梨果渣黃酮粗和VC的還原力能力，由圖11 可知，無籽刺梨果渣黃酮和VC的還原力隨濃度增大顯著（P<0.05）增強(qiáng)。在濃度0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，無籽刺梨果渣黃酮的還原力與VC相當(dāng)，在濃度為0.06 mg/mL時(shí)，無籽刺梨果渣黃酮和VC對應(yīng)的吸光度分別為0.77±0.01、0.73±0.04。隨著濃度升高，無籽刺梨果渣黃酮的還原能力不及VC，且VC還原力隨濃度的升高顯著（P<0.05）下降，原因可能為濃度0.3 mg/mL時(shí)，反應(yīng)體系中Fe3＋被全部還原，繼續(xù)增大VC濃度，過量的VC影響了生成物普魯士藍(lán)的顏色，導(dǎo)致吸光度下降。

圖11 無籽刺梨果渣黃酮和VC的還原力Fig.11 Reducing power of flavonoids from Rosa sterilis pomace and VC

3 結(jié)論

本文對酶-超聲提取無籽刺梨果渣中黃酮影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，采用Box-Behnken法優(yōu)化無籽刺梨果渣中黃酮的提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)：液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、超聲功率300 W、酶解時(shí)間40 min、加酶量0.2%。超聲輔助酶法提取無籽刺梨果渣中黃酮得率達(dá)到87.52 mg/g，回歸模型的實(shí)測值與預(yù)測值（87.78 mg/g）接近，模型可靠?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明，無籽刺梨果渣中黃酮對DPPH·、·OH、均具有一定的清除能力，其對DPPH·、·OH、的EC50值分別為0.0139、0.30788、0.94291 mg/mL，還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度下（0.02～0.06 mg/mL）的還原力與VC相當(dāng)，濃度0.2～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，其還原力不及VC，無籽刺梨果渣中黃酮可作為天然食品抗氧化劑應(yīng)用。