不同組織的快速冰凍切片技術(shù)探討

陳麗旋

（廣東省江門市人民醫(yī)院 病理科，廣東 江門 529000）

0 引言

冰凍切片是臨床快速病理診斷的一種技術(shù)，因其具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[1]，使其在術(shù)前病理診斷中應(yīng)用廣泛。其目的在于了解病變組織性質(zhì)決定手術(shù)方案，了解惡性腫瘤的擴(kuò)散情況確定手術(shù)范圍，確定腫瘤部位的手術(shù)切緣有無腫瘤組織殘留，以及確認(rèn)切除的組織[2]。但由于我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，使外科手術(shù)方式越來越多，從而也相應(yīng)的增加了組織標(biāo)本類型。在以上背景下，對(duì)100例冰凍切片進(jìn)行了相關(guān)研究，為后期冰凍切片提供一定的參考價(jià)值，用以提高切片優(yōu)良率。

1 資料與方法

1.1 一般資料。從廣東省江門市人民醫(yī)院2019年8～10月的冰凍切片中，抽取100例作為本次研究的對(duì)象。其中包括甲狀腺、乳腺、肺、卵巢等。所有組織均為術(shù)中切除并立即送檢的新鮮組織。

1.2 方法。

（1）取材：將未經(jīng)任何處理（無固定，無液體浸泡）的新鮮組織，且組織塊大小厚薄適宜未受擠壓，所選取組織盡量保持組織的原有形態(tài)，并切除組織內(nèi)異物及不需要部分。

（2）組織包埋：①與診斷醫(yī)師取材時(shí)約定好包埋方向，如囊壁組織應(yīng)該豎著埋，對(duì)于有包膜組織可能需要粗切更多令包膜完整；②組織過小時(shí)，冷凍頭需要填補(bǔ)更多OTC包埋劑，并小心進(jìn)刀；③使用OTC包埋劑應(yīng)該適量：擠膠太少不好固定組織，容易造成跳片，使切片厚薄不均且不完整；擠膠太多則會(huì)造成浪費(fèi)且延長(zhǎng)冷凍時(shí)間；④腫瘤過少的標(biāo)本在包埋的時(shí)候做好記號(hào)，避免過度切片造成漏診。

（3）切片：①將凍好的組織塊固定在樣本托上，切片時(shí)，溫度以-15℃至-20℃為宜，根據(jù)不同的組織特性可以進(jìn)行調(diào)節(jié)。如果溫度太低，片子容易卷曲和破碎；如果溫度太高，片子就會(huì)皺成一堆；②調(diào)整好刀片和組織塊的方向，使其垂直。刀片的鋒利性很重要，當(dāng)片子質(zhì)量下降時(shí)最好立即更換刀片；③先切掉表面的包埋劑，直至待取組織露出后調(diào)整好片子厚度開始正式切片。切片厚度根據(jù)不同的組織和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍微厚切；④切出完整的片子后，左手用毛筆輕輕地從上向下展平組織，右手用常溫玻璃載玻片平穩(wěn)地輕壓組織，使其平整地吸附到載玻片上，并迅速放入酒精福爾馬林冰醋酸（AAF）固定液中。

（4）AAF固定液固定后（10～30 s），流水沖洗，進(jìn)入常規(guī)HE染色，脫水、透明后，中性樹膠封片，貼上標(biāo)簽。

（5）不同組織冰凍切片：①微小組織：可將其體積增大，便于切片。先放少量OCT包埋劑在冷凍頭上，用以墊高組織，待其凝固后修平。之后取微小組織置于墊高的OTC包埋劑中，將待切面朝上。然后再放入適量OCT包埋劑置于冰凍切片機(jī)內(nèi)繼續(xù)冷凍。由于微小組織體積較小，所以應(yīng)提高溫度，控制在-18℃至-20℃最佳，以免因溫度過低使微小組織過硬變脆，繼而不利于切片，冷凍1 min后切片；②囊壁樣組織：由于此類組織相對(duì)于較薄，在進(jìn)行切片時(shí)易出現(xiàn)折疊、卷曲現(xiàn)象。所以在取材時(shí)應(yīng)先將組織切成適宜大?。ㄩL(zhǎng)10～15 mm或15～20 mm，寬3 mm），并卷曲成團(tuán)。之后將包埋劑放在冷凍頭上，采用鑷子夾緊組織置于包埋劑中，輕壓組織使其完全浸沒在包埋劑中。同時(shí)保持豎埋狀態(tài)，避免產(chǎn)生氣泡。溫度控制在-15℃至-20℃為宜，冷凍2 min后修整組織塊，切出5～6μm切片，并直接貼附在載玻片上，注意動(dòng)作要輕快；③甲狀腺組織：冷凍溫度以-15℃至-18℃為宜，溫度過高時(shí)，甲狀腺組織變粘，易產(chǎn)生皺褶：溫度過低會(huì)使組織變脆，產(chǎn)生空洞裂隙，此時(shí)，我們可以利用手掌溫度使組織回溫，以便切出平整完整的切片；④富含脂肪類組織：該類組織呈黏液樣或魚肉樣，內(nèi)含脂肪空泡，質(zhì)軟，如乳腺組織、帶有較多脂肪的淋巴結(jié)等。所以溫度必須更低，冷凍時(shí)間更久。溫度控制在25℃至-30℃最佳，冷凍時(shí)間3 min，當(dāng)OTC包埋劑凝固組織變硬后切片，切片厚度8～10μm甚至更厚，切片時(shí)速度一定要快，不然容易發(fā)生切片粘連，且染色時(shí)沖洗不宜過急和需縮短分化時(shí)間，以免出現(xiàn)脫片；⑤肺組織：屬于疏松結(jié)締組織，溫度過高，切片過薄均容易造成組織切片空洞、篩狀，故我們將溫度控制稍低于日常使用，以-22℃最佳，厚度調(diào)至大于5 μm（以7 μm為宜），這樣使切片更加完整；⑥腦組織。腦組織質(zhì)軟，水份較多，冰凍切片易形成冰晶。一般選用不含水份的OCT包埋劑，溫度控制在18℃～20℃為宜，冷凍時(shí)間宜短，控制在2 min內(nèi)，切片時(shí)動(dòng)作輕巧，黏貼切片時(shí)不可重壓，切片后用冷風(fēng)吹干，固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)，這樣既可防止切片皺褶、冰晶、胞核固縮、核聚集、結(jié)構(gòu)松散等人為假象的產(chǎn)生；⑦含脂肪較多的組織。這類組織包括乳腺、脂肪組織來源的腫瘤等，質(zhì)地較軟，內(nèi)含脂肪空泡，冷凍溫度必需低，時(shí)間也要長(zhǎng)，一般溫度為28℃～30℃，時(shí)間8 min，組織稍硬時(shí)方宜切片，并可適宜增加切片厚度6～8 μm，切片時(shí)進(jìn)刀要快，染色時(shí)不宜加熱，否則宜造成切片粘連、脫片等；⑧含纖維、肌肉成份較多的組織。這類組織的代表是纖維瘤、平滑肌瘤等，一般組織硬、韌，取材時(shí)切成方形，切片時(shí)將組織對(duì)角線與刀片平行放置，減少組織作于刀片的阻力。冷凍溫度一般在23℃～25℃，冷凍時(shí)間不能過長(zhǎng)，一般組織冷凍至八成時(shí)切片較佳，否則一旦組織過硬，很難切片，而且厚薄不均，易脫片；⑨皮膚組織。皮膚表皮較硬，皮下結(jié)締組織及脂肪組織較軟，故皮膚組織形成軟硬度差，冷凍溫度和時(shí)間是不一致的。我們一般將溫度控制在-23℃至-25℃，顧及到軟的組織冷凍至能切片為宜。切片時(shí)應(yīng)先切軟的部分，即依次切真皮，表皮，這樣一般都能切出完整的切片。

1.3 觀察指標(biāo)。對(duì)比不同切片質(zhì)量及診斷效能。根據(jù)切片完整度、平整度、染色、透明、封裱等情況，將切片分為優(yōu)、良、中、差4個(gè)等級(jí)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)采用%表示，計(jì)量采用（±s）表示，使用χ2/t校檢；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同切片切片質(zhì)量對(duì)比。冰凍切片質(zhì)量大多為優(yōu)，優(yōu)良率為96%，與石蠟切片優(yōu)良率98%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 不同切片切片質(zhì)量對(duì)比[n(%)]

2.2 不同切片診斷效能對(duì)比。兩種切片在誤診率、診斷準(zhǔn)確率上數(shù)據(jù)差異無計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但冰凍切片診斷時(shí)間（0.45±0.22）h，要短于石蠟切片（36.25±12.16）h，組間數(shù)據(jù)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同切片診斷效能對(duì)比

3 討論

優(yōu)良的切片是準(zhǔn)確診斷的前提[3]，但由于不同組織結(jié)構(gòu)不同，使切片條件也存在少許差異，尤其是對(duì)于不同組織所需溫度更難掌握，繼而影響了冰凍切片的質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示，冰凍切片質(zhì)量大多為優(yōu)，優(yōu)良率為96%，與石蠟切片優(yōu)良率98%相比，差異無在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩種切片在誤診率、診斷準(zhǔn)確率上數(shù)據(jù)差異無在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但冰凍切片診斷時(shí)間（0.45±0.22）h，要短于石蠟切片（36.25±12.16）h，組間數(shù)據(jù)對(duì)比差異有在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明了冰凍切片的臨床應(yīng)用效果基本與石蠟切片相近，但冰凍切片診斷所需時(shí)間更短。高質(zhì)量的冰凍切片除了取材規(guī)范、切片刀鋒利外，組織的冷凍時(shí)間和冷凍程度很關(guān)鍵，冷凍過硬或冷凍不夠都切不出優(yōu)質(zhì)的切片?？偨Y(jié)應(yīng)注意以下幾個(gè)環(huán)節(jié)。①取材送檢。送檢組織不需固定，避免遇水，如本身含水分較多，應(yīng)用濾紙吸干，目的在于防止切片產(chǎn)生空洞、冰晶；取材中盡量避免脂肪組織和壞死組織，以免制不出片子；取材組織塊厚度不超過3 mm，防止冷凍時(shí)間過長(zhǎng)造成組織干、硬、脆；②冷凍溫度。應(yīng)根據(jù)組織大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)組成的不同調(diào)節(jié)不同的溫度。溫度過低，組織塊硬，切片碎裂；溫度過高，組織塊硬度不夠，切片不成形。如組織已很脆，可等幾分鐘或用手按壓組織，將組織回暖片刻再切。所以要獲得一張既薄又完整的切片，控制最佳溫度很關(guān)鍵。我們的經(jīng)驗(yàn)是：微小組織18℃～19℃；囊壁樣組織26℃～28℃；甲狀腺、淋巴結(jié)、腦18℃～20℃；乳腺、脂肪含量高的腫瘤28℃～30℃；皮膚、纖維、肌肉23℃～25℃；③包埋。選用包埋劑處理時(shí)，冷凝后將其修片再切。另外冷凍頭不要預(yù)先冷凍，以免溫差太大包埋劑不能與冷凍頭牢固結(jié)合而脫落；④切片、固定。提前做好準(zhǔn)備，如刀要鋒利，按在刀架上，調(diào)節(jié)好角度等。切片手搖用力要均勻、柔和，搖速合適，抗卷板與刀鋒間距離要合適。切片后立刻放入酒精固定，這樣組織不易退變、收縮，且染色清晰；⑤染色、封片。HE染色應(yīng)著色佳、清晰透明，胞質(zhì)胞核分明，對(duì)比度好，為此應(yīng)及時(shí)更換無水酒精及二甲苯，以免脫水不凈致切片不透明，出現(xiàn)云霧。封片時(shí)要防止氣泡及溢液，使得切片整潔。冰凍切片是將組織置于低溫條件下快速冷卻到一定硬度，然后再進(jìn)行切片。但不同組織所需要的冷凍溫度不一樣，而溫度過高或過低會(huì)導(dǎo)致組織過硬或過軟[5]。一般柔軟稚嫩富含水分的組織溫度設(shè)置在-10℃至-25℃，以免出現(xiàn)溫度較低使切片呈碎屑狀，而對(duì)于致密富含脂肪的組織則溫度設(shè)置在-25℃至-35℃，以免造成切片堆積不能形成片狀。冰凍切片在30 min之內(nèi)就可以得到病人病理報(bào)告。因其快捷、簡(jiǎn)便，所以常用于手術(shù)中的快速病理診斷。石蠟切片則需要將切下的病變組織經(jīng)過固定、取材、脫水等一系列技術(shù)處理，所以其診斷時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。但由于冰凍切片是通過冷凍來獲得硬度從而制成的切片，當(dāng)組織冰凍后，可造成細(xì)胞變形，形成冰晶等人為假象影響了對(duì)組織的觀察，加上檢查材料有限，增加了診斷難度，且冰凍切片的片子，相對(duì)于石蠟切片，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的保存較差，且保存時(shí)間較短[6]。不過，冰凍切片剩余的組織，相對(duì)固定較及時(shí)充分，故其抗原性保存較好，在后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色中應(yīng)用更好。

綜上所述，快速冰凍切片技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值較高，具有“快和準(zhǔn)”的特點(diǎn)。為手術(shù)進(jìn)展提供科學(xué)依據(jù)，特別是對(duì)惡性腫瘤手術(shù)，手術(shù)醫(yī)師可以直接根據(jù)病理結(jié)果選擇手術(shù)方式及手術(shù)范圍，優(yōu)化手術(shù)方案，有效地避免了二次手術(shù)及損傷。但組織受冰凍后，可造成細(xì)胞變形，發(fā)生人為假象，加上檢查材料有限，增加了診斷難度，存在誤診及微小病灶漏診的可能。同時(shí)快速冰凍切片技術(shù)也是較難掌握的技術(shù)之一。因此在實(shí)際操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范操作，盡量保證切片的質(zhì)量，減少漏診、誤診概率。并對(duì)于小部分難以做出明確診斷的病例，需等待石蠟切片進(jìn)行最終診斷。