薯蕷皂苷元改善類風濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹的效果及作用機制研究

張華燕，何援軍

(浙江衢化醫(yī)院，浙江 衢州 324004)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性細胞浸潤為特征，導致滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及骨退變的一種慢性全身性自身免疫性疾病[1]，具有發(fā)病率高、病程長、難治愈、致殘率高的特點，10%的患者會在數(shù)年內(nèi)喪失勞動力[2-3]。RA早期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)游走性疼痛及功能障礙，晚期則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬與畸形[4]。由于RA的病因與發(fā)病機制尚不明確，而抗生素類藥物在本病治療中效果有限，并存在一定不良反應，因此尋找更加安全有效的治療方法具有重要的價值。薯蕷皂苷元為穿山龍的根莖提取物，是穿山龍總皂苷的主要成分，具有舒筋活絡(luò)、祛風止痛的功效[5]。現(xiàn)代醫(yī)學研究顯示，薯蕷皂苷元能夠減輕炎性反應[6-9]。為探討薯蕷皂苷元對于RA關(guān)節(jié)腫脹的改善效果及作用機制，我們進行了動物實驗，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物6周齡SPF級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～200 g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可號：SCXK(滬)2019-0002。在溫度23～25 ℃、濕度60%～65%環(huán)境中，晝夜12 h交替適應性飼養(yǎng)。實驗方案通過醫(yī)學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要試劑薯蕷皂苷元(北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%)，雞源性Ⅱ型膠原(Sigma-Aldrich公司)，Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體通路激活劑尼日利亞菌素鈉鹽(西安樂森生物科技有限公司)，甲醇、氯仿(鄭州建祥化工產(chǎn)品有限公司)，兔抗鼠白細胞介素(interleukin，IL)-1β、NLRP3單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(Abcam公司)，IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒(上海恒遠生物公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.3 實驗儀器ST-360酶標儀(上?？迫A生物股份有限公司)，WMS-1030生物顯微鏡(上海豫光儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 造模及分組從70只大鼠中隨機選取55只，按照李立萍等[10]的方法建立Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠模型。具體方法如下：按照30 mg·kg-1腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在右后足跖皮內(nèi)注射100 μL Ⅱ 型膠原乳劑(雞源性Ⅱ型膠原溶于0.01 mol·L-1乙酸中，使終濃度為5 mg·mL-1，與等體積弗氏完全佐劑冰浴混合，充分乳化制成)；1周后，在右后肢注射100 μLⅡ型膠原乳劑加強免疫1次。剩余15只納入空白組，先給予等量0.01 mol·L-1乙酸，1周后仍給予等量0.01 mol·L-1乙酸。4周后，由2名實驗人員觀察大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，依據(jù)文獻[11]進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評定：無關(guān)節(jié)炎為0分；個別足趾及足底腫脹為1分；大部分足趾及足底腫脹為2分；踝關(guān)節(jié)及以下腫脹為3分；腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上，不能負重為4分。取2名實驗人員評定的平均值作為最終評定結(jié)果，評分≥2分判定為造模成功。

將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、薯蕷皂苷元組、激活劑組，每組16只。造模成功后2 d，薯蕷皂苷元組按100 mg·kg-1腹腔注射薯蕷皂苷元(薯蕷皂苷元溶于甲醇，用生理鹽水稀釋至甲醇體積分數(shù)為5%)，空白組、模型組及激活劑組注射等量含5%甲醇的生理鹽水。1 h后激活劑組按100 mg·kg-1腹腔注射尼日利亞菌素鈉鹽[尼日利亞菌素鈉鹽溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，用生理鹽水稀釋至DMSO體積分數(shù)為5%]，薯蕷皂苷元組、空白組、模型組注射等量含5% DMSO的生理鹽水。每天干預1次，共干預2周。

2.2 實驗指標測定干預2周后，先對各組大鼠進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評定，然后將各組大鼠麻醉后自腹腔靜脈取血5 mL，干燥管和抗凝管中各保存2.5 mL，以4000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，分別從干燥管和抗凝管中提取上清液，即為血清和血漿，于-20 ℃保存，用于炎癥因子和氧化應激因子含量檢測。

采血后，在各組大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)正中做縱切口，分離肌肉，繼續(xù)分離可見平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出滑膜層組織。一部分HE染色后進行滑膜組織病理學觀察，另一部分(-80℃保存)以Western Blot法檢測滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關(guān)蛋白含量。

2.2.1關(guān)節(jié)腫脹情況評定 采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)[11]評定各組大鼠右后肢的腫脹情況。

2.2.2外周血炎癥因子含量測定 取-20 ℃保存的血清，室溫下解凍，用ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-6、TNF-α含量。按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度(A值)，通過繪制標準曲線得出IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.2.3外周血氧化應激因子含量測定 取保存在-20 ℃的血漿，室溫下解凍，分別測定其中MDA、SOD、GSH的含量，均按照對應試劑盒說明書加樣。以硫代巴比妥酸法測定并計算MDA含量，以嘌呤氧化酶法測定并計算SOD含量，以ELISA法測定并計算GSH含量。

2.2.4滑膜組織病理學觀察 用于組織病理學觀察的滑膜組織樣品，用10%甲醛固定36 h，經(jīng)流水沖洗、9%硝酸脫鈣、閉光過夜、梯度乙醇脫水(低濃度到高濃度)、二甲苯透明處理后，置于已溶化的石蠟中包埋、切片，切片厚度5 μm。將切片于熱水中燙平，貼于載玻片上，在45 ℃恒溫箱烘干。二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水(高濃度到低濃度)，蒸餾水浸泡片刻，蘇木精水溶液染色5 min，酸水及氨水中分色，各5 s。流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻。在70%、90%乙醇中各脫水10 min。酒精伊紅染色液染色3 min，再經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片后，在顯微鏡觀察。

2.2.5滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關(guān)蛋白含量測定 取-80 ℃保存的關(guān)節(jié)滑膜組織，液氮速凍研磨后加入蛋白提取裂解液，冰上裂解、離心后取上清液。加入SDS上樣緩沖液，95 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；洗膜后加入1∶1000稀釋的IL-1β、Caspase-1及NLRP3一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入1∶4000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影。采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，IL-1β、Caspase-1及NLRP3相對表達量用蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)、外周血炎癥因子含量、外周血氧化應激因子含量、滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關(guān)蛋白含量的組間總體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 關(guān)節(jié)腫脹情況評定結(jié)果各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義。激活劑組和薯蕷皂苷元組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均低于模型組(P=0.001，P=0.000)，薯蕷皂苷元組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)低于激活劑組(P=0.000)。見表1。

3.2 外周血炎癥因子含量測定結(jié)果各組大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均高于空白組(IL-1β：P=0.001，P=0.000，P=0.002；IL-6：P=0.001，P=0.000，P=0.016；TNF-α：P=0.000，P=0.002，P=0.043)；激活劑組和薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于模型組(IL-1β：P=0.003，P=0.000；IL-6：P=0.002，P=0.000；TNF-α：P=0.031，P=0.001)；薯蕷皂苷元組的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于激活劑組(P=0.021，P=0.002，P=0.046)。見表1。

3.3 外周血氧化應激因子含量測定結(jié)果各組大鼠的血漿MDA、SOD、GSH含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組的血漿MDA含量均高于空白組(P=0.000，P=0.000，P=0.001)，血漿SOD、GSH含量均低于空白組(SOD：P=0.000，P=0.000，P=0.001；GSH：P=0.000，P=0.000，P=0.002)；激活劑組及薯蕷皂苷元組的血漿MDA含量均低于模型組(P=0.000，P=0.000)，血漿SOD、GSH含量均高于模型組(SOD：P=0.000，P=0.000；GSH：P=0.001，P=0.000)；激活劑組的血漿MDA含量高于薯蕷皂苷元組(P=0.007)，血漿SOD、GSH含量均低于薯蕷皂苷元組(P=0.002，P=0.003)。見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、外周血炎癥因子及氧化應激因子含量

3.4 滑膜組織病理學觀察結(jié)果空白組關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常；模型組關(guān)節(jié)滑膜組織有炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生，血管擴張，形成血栓；激活劑組關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化較模型組改善，但有輕微滑膜細胞增生；薯蕷皂苷元組關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色圖片(×200)

3.5 滑膜組織NLRP3炎性體信號通路相關(guān)蛋白含量測定結(jié)果各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義；模型組、激活劑組及薯蕷皂苷元組滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均高于空白組(IL-1β：P=0.000，P=0.001，P=0.042；Caspase-1：P=0.000，P=0.000，P=0.006；NLRP3：P=0.000，P=0.001，P=0.013)；激活劑組和薯蕷皂苷元組的IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于模型組(IL-1β：P=0.001，P=0.000；Caspase-1：P=0.006，P=0.000；NLRP3：P=0.007，P=0.000)；薯蕷皂苷元組的IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于激活劑組(P=0.007，P=0.018，P=0.046)。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠滑膜組織IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量Western Blot法檢測結(jié)果

4 討 論

RA的病因以及發(fā)病機制比較復雜，至今仍未完全明確，但一般認為是因某種未知的外來抗原作用于有易感基因的個體，機體對外來抗原出現(xiàn)免疫反應的同時，通過分子模擬或誘導自身免疫耐受的破壞而引起自身免疫反應[12-13]。目前治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥和免疫抑制劑，這類藥物雖能較好地控制臨床癥狀，但不能有效防止骨侵蝕[14-15]。近年來，中醫(yī)藥在治療RA方面已顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，并受到了國內(nèi)外學術(shù)界的青睞。

組別樣本量/只IL-1β1)含量(x±s)Caspase-12)含量(x±s)NLRP33)含量(x±s)空白組150.46±0.070.54±0.080.69±0.08模型組161.02±0.101.16±0.121.27±0.12激活劑組160.72±0.080.90±0.101.01±0.11薯蕷皂苷元組160.56±0.060.73±0.080.88±0.09F值31.02523.65828.754P值0.0000.0000.000

現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，穿山龍的有效成分甾體皂苷能改善免疫功能，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止咳祛痰、降糖降尿酸等藥理作用[7,16]。Song等[17]的研究表明，穿山龍可能是通過抑制外周炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而起到鎮(zhèn)痛作用。Ou-Yang等[18]認為，穿山龍能明顯抑制肉芽組織增生和炎癥早期的毛細血管滲出。魏志萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可通過抑制環(huán)氧合酶2的表達，抑制TNF-α誘導的關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞異常增殖。王文云等[20]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可以通過促進M2型小膠質(zhì)細胞極化，并抑制M1型小膠質(zhì)細胞極化發(fā)揮抗炎作用。本研究中，與模型組相比，薯蕷皂苷元組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，氧化應激因子MDA含量降低，氧化應激因子SOD、GSH含量升高，而且關(guān)節(jié)滑膜組織病變明顯改善，提示薯蕷皂苷元能調(diào)節(jié)RA模型大鼠的免疫反應，緩解關(guān)節(jié)腫脹。

NLRP3炎性體是一種存在于細胞質(zhì)的蛋白復合物，能被多種內(nèi)外因素所激活；活化其效應蛋白Caspase-1，可將無活性的促炎細胞因子IL-1β和IL-18的前體剪切加工成熟并釋放，參與機體抵抗病原體的免疫應答反應；一旦體內(nèi)對NLRP3炎性體的調(diào)控失衡，可生成過量的IL-1β和IL-18，從而引發(fā)一系列炎癥性疾病[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎性體通路，能夠抑制炎癥因子的表達，緩解機體內(nèi)炎癥反應[23-24]。本研究中，薯蕷皂苷元組和激活劑組滑膜組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量均低于模型組，但激活劑組滑膜組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3含量高于薯蕷皂苷元組，提示薯蕷皂苷元可能通過下調(diào)IL-1β、Caspase-1、NLRP3的表達，抑制NLRP3炎性體通路發(fā)揮治療作用。

本研究結(jié)果提示，薯蕷皂苷元能有效緩解RA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，其作用機制可能是通過下調(diào)IL-1β、Caspase-1、NLRP3的表達，抑制NLRP3炎性體信號通路介導的炎性反應。