多種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測對骨肉瘤的診斷價值研究

羅漫麗，黃滿玉，李東升，馬言，張勇勇，羅亞鴿，李記天，代麗萍

(1.鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 鄭州 450001；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450016)

骨肉瘤是10～20歲青少年最常發(fā)生的骨腫瘤[1]，惡性度極高，預(yù)后較差[2]。骨肉瘤的高致殘率和死亡率在一定程度上可歸因于缺乏有效的早期診斷手段。腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)抗體系統(tǒng)已被證實對多種腫瘤具有良好的診斷效能[3-7]。TAA自身抗體的含量在癌變早期就已經(jīng)增加[8]，即使抗原含量很低[9]，甚至已經(jīng)被清除[10]，對應(yīng)自身抗體的含量依然很高且穩(wěn)定[11]。但單個TAA自身抗體診斷骨肉瘤的準確性較差。為此，本研究依據(jù)前期研究結(jié)果，擬從抗烯醇化酶1(enolase 1，ENO1)自身抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)自身抗體、抗熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)27自身抗體、抗HSP60自身抗體、抗核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin 1，NPM1)自身抗體、抗人PDZ和LIM域蛋白1(PDZ and LIM domain 1，PDLIM1)自身抗體、抗重組人微管解聚蛋白1(stathmin 1，STMN1)自身抗體和抗丙糖磷酸異構(gòu)酶1(triosephosphate isomerase 1，TPI1)自身抗體共8種血清TAA自身抗體中篩選一組TAA自身抗體組合，聯(lián)合檢測以提高早期診斷骨肉瘤的準確率，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 臨床資料

受試對象為2013年12月至2016年6月在河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)骨腫瘤科門診就診或住院治療的骨肉瘤患者(骨肉瘤組)，以及同時期在醫(yī)院體檢的健康志愿者(健康組)。骨肉瘤組51例，男33例、女18例。年齡4～64歲，中位數(shù)20歲。所有骨肉瘤患者均結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學及病理學檢查結(jié)果確診。患者就診前未針對骨肉瘤進行放射治療、化學藥物治療及手術(shù)治療；均不合并其他原發(fā)腫瘤及肝、腎、免疫系統(tǒng)疾病。健康組51例，男33例、女18例。年齡5～59歲，中位數(shù)25歲。試驗方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過。

2 方 法

2.1 標本收集與處理試驗所用血清為受試對象就診或體檢時保存的血清樣本。清晨空腹狀態(tài)下采集外周血，標本收集后30 min內(nèi)以3000 r·min-1離心10 min(離心半徑10 cm)，提取血清，置于-80 ℃冰箱保存。此次試驗抗體檢測前，于4 ℃冰箱中緩慢解凍，避免反復(fù)凍融。

2.2 血清TAA自身抗體含量檢測使用間接ELISA法檢測所有受試對象血清中抗ENO1自身抗體、抗GAPDH自身抗體、抗HSP27自身抗體、抗HSP60自身抗體、抗NPM1自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗STMN1自身抗體、抗TPI1自身抗體等8種TAA自身抗體的含量。將各抗原用包被液稀釋到1.0 μg·mL-1，每孔100 μL包被到酶標板上，4 ℃孵育過夜。吸棄酶標板中的包被液，每孔加入2%牛血清蛋白200 μL，在室溫下封閉2 h。棄掉板中液體，以PBST(PBS中加入0.05%的Tween 20)洗板3次。將研究對象的血清按1∶100的比例稀釋，每孔100 μL包被在酶標板上，37 ℃半水浴孵育1 h，同時加入陰性和陽性血清作為對照，空白對照孔中加入抗體稀釋液。PBST洗板5次，拍干。以辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(H+L)作為二抗(1∶4000稀釋)，37 ℃半水浴孵育1 h，再用PBST洗板5次。檢測試劑采用EL-ABTS顯色試劑盒，顯色液每孔100 μL，避光條件下37 ℃水浴15 min后加入終止液50 μL，使用全長酶標儀檢測405 nm處的光密度值(OD值)。每種自身抗體檢測2次，最終結(jié)果取平均值。

2.3 血清TAA自身抗體含量檢測診斷骨肉瘤的結(jié)果評價按單側(cè)估計各TAA自身抗體含量的95%參考值范圍，≥參考值即判定為骨肉瘤，以此計算和評價各TAA自身抗體血清含量檢測診斷骨肉瘤的價值。按診斷的靈敏度由高到低排序，從靈敏度最高的自身抗體開始，每次增加1種靈敏度排名次一位的自身抗體，計算和評價對應(yīng)的TAA自身抗體聯(lián)合檢測診斷骨肉瘤的價值。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，2組受試對象血清TAA自身抗體含量的組間比較均采用Mann-Whitney U檢驗，檢驗水準α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 血清TAA自身抗體含量檢測結(jié)果2組受試對象血清中抗ENO1自身抗體、抗GAPDH自身抗體、抗HSP27自身抗體、抗HSP60自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗STMN1自身抗體和抗TPI1自身抗體含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義；2組受試對象血清中抗NPM1自身抗體含量比較，差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 2組受試對象8種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體血清含量

3.2 血清TAA自身抗體含量檢測診斷骨肉瘤的結(jié)果除抗NPM1自身抗體之外的7種TAA自身抗體中，抗STMN1自身抗體診斷骨肉瘤的價值最大，其靈敏度為27.45%、特異度為96.08%、Youden指數(shù)為0.2353、Kappa值為0.24(表2)。隨著聯(lián)合檢測的TAA自身抗體種類增加，診斷的靈敏度逐漸增大、特異度逐漸減小，當聯(lián)合檢測抗STMN1自身抗體、抗TPI1自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗ENO1自身抗體和抗HSP27自身抗體5種血清TAA自身抗體時，診斷效果比較理想，對應(yīng)的靈敏度為60.78%、特異度為80.39%、Youden指數(shù)為0.411 8、符合率為70.59%、Kappa值為0.41(表3)。

表2 7種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體血清含量檢測診斷骨肉瘤的結(jié)果

表3 多種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體血清含量聯(lián)合檢測診斷骨肉瘤的結(jié)果

4 討 論

由于骨肉瘤具有較高的致殘率和死亡率，因此早期診斷非常重要[12]。自身抗體作為一種自身免疫現(xiàn)象已經(jīng)在許多研究中被應(yīng)用，可作為疾病早期篩查的一種有效手段[13-14]。根據(jù)前期研究結(jié)果，本研究采用間接ELISA法檢測抗ENO1自身抗體、抗GAPDH自身抗體、抗HSP27自身抗體、抗HSP60自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗STMN1自身抗體、抗TPI1自身抗體和抗NPM1自身抗體的血清含量。其中前7種解聚蛋白1；7)丙糖磷酸異構(gòu)酶1。

TAA自身抗體的血清含量在骨肉瘤組和健康組之間的差異有統(tǒng)計學意義。然而，單一的TAA自身抗體診斷骨肉瘤的價值有限?；诖?，本研究對各TAA自身抗體聯(lián)合檢測診斷骨肉瘤的效果進行了評價，當聯(lián)合檢測抗STMN1自身抗體、抗TPI1自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗ENO1自身抗體和抗HSP27自身抗體等5種血清TAA自身抗體時的診斷效果較為理想，對應(yīng)的靈敏度為60.78%、特異度為80.39%、Youden指數(shù)為0.4118、符合率為70.59%、Kappa值為0.41。

STMN1作為一種在多種腫瘤中均存在的胞漿磷蛋白，其在骨肉瘤組織中的含量可用于判斷骨肉瘤的預(yù)后[15]。Chen等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，包含TPI1和ENO1基因的一組標志物可以診斷骨肉瘤。一項關(guān)于PDLIM1自身抗體和乳腺癌的研究表明，高滴度的抗PDLIM1自身抗體在乳腺癌病例組中顯著高于對照組[17]。Moon等[18]的研究表明，HSP27可作為鑒別常規(guī)骨肉瘤與低級別中心型骨肉瘤的標志物，也可作為骨肉瘤的一個潛在預(yù)后標志物。

Gao等[19]的研究表明，通過幾種循環(huán)miRNAs的組合診斷骨肉瘤具有較高的準確性，其靈敏度、特異度和ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為79%、89%和0.90，但循環(huán)miRNAs的檢測對樣本的處理要求較高。截至目前，尚未見到應(yīng)用自身抗體組合早期診斷骨肉瘤的研究報道。但在針對其他類型腫瘤的研究中，聯(lián)合檢測自身抗體被證明具有較高的診斷價值。Wang等[20]找到了9種自身抗體(V-Ral猴白血病病毒癌基因同源物A、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2、腫瘤抑制蛋白53、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白3、蛋白磷酸酶2A癌抑制因子、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子、癌基因c-Myc結(jié)合蛋白、α2-HS糖蛋白、14-3-3蛋白zeta)作為診斷卵巢癌的最佳組合，其靈敏度和特異度分別為61.4%和85.0%，當結(jié)合臨床上常用的糖類抗原125時，其靈敏度、特異度和AUC分別達到94.7%、78.2%和0.914。Zhang等[21]選擇了一組包括4種抗體的組合，這個組合在診斷食管癌的訓練集中的AUC為0.838、在驗證集中AUC為0.872，具有較高的診斷效能。Wang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子 2 mRNA 結(jié)合蛋白2、癌基因c-Myc結(jié)合蛋白、核仁磷酸蛋白1、14-3-3蛋白zeta、鼠雙微體2蛋白和細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子等6種自身抗體的組合對胃癌尤其是早期胃癌具有較高的診斷價值，在訓練集中AUC為0.841、在驗證集中AUC為0.856。基于這些研究，早期使用自身抗體的組合來診斷骨肉瘤是完全可行的。

本研究的結(jié)果提示，聯(lián)合檢測抗STMN1自身抗體、抗TPI1自身抗體、抗PDLIM1自身抗體、抗ENO1自身抗體和抗HSP27自身抗體5種血清TAA自身抗體，對骨肉瘤具有較高的診斷價值。本研究的局限性在于納入的骨肉瘤患者較少，今后應(yīng)增加樣本以進一步驗證該診斷方案的可靠性。