miR-96-5p調(diào)控FOXO4表達(dá)影響人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡

張嵐 田榮

瘢痕疙瘩是皮膚組織受損后異常愈合的一種皮膚瘤，主要原因在于皮膚成纖維細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致細(xì)胞膠原分泌量增加進(jìn)而促使結(jié)締組織增生或變形最終形成瘢痕[1,2]。瘢痕疙瘩的形成已嚴(yán)重影響患者身心健康，目前臨床主要采用手術(shù)、藥物、激光等技術(shù)進(jìn)行治療，但治療效果不佳，患者復(fù)發(fā)率高。研究表明促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖可有效改善瘢痕疙瘩[3]。因而基于瘢痕疙瘩形成的分子機(jī)制擬尋找治療靶點(diǎn)從而提高治療效果及降低復(fù)發(fā)率。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調(diào)控基因表達(dá)從而參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程，研究表明部分miRNA在瘢痕疙瘩中異常表達(dá)，并可調(diào)控多種基因表達(dá)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[4]。微小RNA-96-5p(microRNA-96-5p，miR-96-5p)可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程[5]。研究表明miR-96-5p在宮頸癌中上調(diào)表達(dá)，抑制miR-96-5p表達(dá)可抑制宮頸癌進(jìn)展[6]。但miR-96-5p在瘢痕疙瘩形成過程中的調(diào)控機(jī)制尚未可知。Starbase預(yù)測顯示叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4(forkhead box O4，F(xiàn)OXO4)可能是miR-96-5p的靶基因，研究表明FOXO4在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。目前miR-96-5p是否可通過調(diào)控FOXO4的表達(dá)參與瘢痕疙瘩形成過程尚未可知。本研究主要探討miR-96-5p在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、凋亡的影響，分析其對FOXO4的調(diào)控作用，旨在為瘢痕疙瘩的診斷及治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 瘢痕組織與正常皮膚組織來源：收集2017年6月至2018年3月我院外科需手術(shù)切除的瘢痕組織離體標(biāo)本(30例)，收集患者臨床病理資料，主要包括性別、年齡、皮損部位等，男16例，女14例；年齡20～35歲，平均年齡(25.54±5.46)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；向周圍侵襲性生長超出原損傷范圍；外科手術(shù)切除后復(fù)發(fā)；皮損部位無感染病灶。正常皮膚組織離體標(biāo)本15例，其中男8例，女7例；年齡18～46歲，平均年齡(28.54±5.49)歲；患者接受皮膚外科手術(shù)中修整“貓耳”切除的正常皮膚組織作為正常組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書。

1.1.2 試劑與儀器：杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司；miR-96-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-96-5p)及陰性對照(anti-miR-NC)、miR-96-5p模擬物(mimics)、陰性對照(miR-NC)、FOXO4小干擾RNA(si-FOXO4)、亂序無意義陰性對照(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司； pcDNA3.1購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海生工生物工程股份有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗人FOXO4抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng):取出瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織，除去表皮及皮下脂肪，無菌鹽水沖洗，剪切成1 cm×1 cm×1 cm的組織塊，接種至無菌培養(yǎng)瓶，加入2 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，待組織塊周圍長滿細(xì)胞時(shí)將其轉(zhuǎn)移至另一新的無菌培養(yǎng)瓶。取出培養(yǎng)瓶，棄舊培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入1 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，3～5 min后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，加入2 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，按照1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組:取對數(shù)期瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，按照每孔3×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合度為30%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000說明書分別將anti-miR-96-5p(anti-miR-96-5p組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、pcDNA-FOXO4(pcDNA-FOXO4組)、pcDNA-NC(pcDNA-NC組)、anti-miR-96-5p與si-NC(anti-miR-96-5p+si-NC組)、anti-miR-96-5p與si-FOXO4(anti-miR-96-5p+si-FOXO4組)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-96-5p、FOXO4 mRNA的表達(dá)水平:采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-96-5p正向引物5’-GCGCTCTTCTTTGCCTGTTT-3’，反向引物5’-AGCATGTCTGTCTTGTCCCA-3’；U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；FOXO4 正向引物5’-TCCTCACTCCTACCATCCCA-3’，反向引物5’-GTCAAGAGAGCCTCCAGTGT-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。miR-96-5p以U6為內(nèi)參，F(xiàn)OXO4以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-96-5p、FOXO4 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖:收集各組轉(zhuǎn)染的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，按照每孔100 μl的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)每孔加入MTT溶液20 μl(質(zhì)量濃度5 mg/ml)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，室溫條件下經(jīng)1 300 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑8 cm)，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集各組對數(shù)期瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min(離心半徑6 cm)，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫孵育10 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-96-5p的靶基因:starbase預(yù)測FOXO4與miR-96-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-FOXO4，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，將突變位點(diǎn)插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建突變型載體MUT-FOXO4，取生長狀態(tài)良好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，分別將WT-FOXO4、MUT-FOXO4與miR-NC、miR-96-5p mimics共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，檢測相對熒光素酶活性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測miR-96-5p過表達(dá)或抑制miR-96-5p表達(dá)對FOXO4表達(dá)水平的影響，實(shí)驗(yàn)分組：miR-NC組、miR-96-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-96-5p組。

1.2.7 Western Blot檢測FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá):收集各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，室溫條件下孵育一抗(FOXO4 1∶800、CyclinD1 1∶1 000、C-caspase-3 1∶1 000)稀釋液，4℃孵育過夜，TBST洗滌，孵育二抗(1∶2 000)稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL，曝光，顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-96-5p、FOXO4的表達(dá)情況 與正常組比較，瘢痕組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-96-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)OXO4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中 miR-96-5p和FOXO4表達(dá)量

圖1 Western Blot檢測FOXO4

2.2 低表達(dá)miR-96-5p對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-96-5p組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-96-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。提示成功降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-96-5p的表達(dá)。相對于anti-miR-NC組，anti-miR-96-5p組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 低表達(dá)miR-96-5p對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 低表達(dá)miR-96-5p對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;B Western Blot檢測CyclinD1、C-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.3 高表達(dá)FOXO4對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示，pcDNA-FOXO4組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中FOXO4蛋白相對表達(dá)量顯著高于pcDNA-NC組(P<0.05)。與pcDNA-NC組相比，pcDNA-FOXO4組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 Western Blot檢測FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白的表達(dá)

表3 高表達(dá)FOXO4對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4 miR-96-5p靶向FOXO4 starbase預(yù)測顯示FOXO4與miR-96-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因載體WT-FOXO4的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-96-5p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因載體MUT-FOXO4的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-96-5p組熒光素酶活性相較于miR-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-96-5p組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中FOXO4蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-96-5p組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中FOXO4蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖4。

圖4 miR-96-5p靶向FOXO4；A starbase對FOXO4和 miR-96-5p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖；B Western Blot檢測FOXO4蛋白的表達(dá)

表4 miR-NC或miR-96-5p與FOXO4野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5 低表達(dá)FOXO4可以部分逆轉(zhuǎn)miR-96-5p低表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與anti-miR-96-5p+si-NC組相比，anti-miR-96-5p+si-FOXO4組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中FOXO4蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖5，表6。

表5 Western Blot檢測FOXO4 蛋白的表達(dá)

圖5 Western Blot檢測FOXO4、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)

表6 低表達(dá)FOXO4可以部分逆轉(zhuǎn)miR-96-5p低表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

瘢痕形成與成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原蛋白異常沉積密切相關(guān)，研究表明成纖維細(xì)胞增殖、凋亡等可能與抑癌基因失活及癌基因激活有關(guān)[8,9]。既往研究顯示miRNA在瘢痕形成過程過程發(fā)揮重要調(diào)控作用，但關(guān)于其調(diào)控機(jī)制尚未闡明[10]。因此本研究探尋新型miRNA并分析其在瘢痕形成過程中的作用機(jī)制，為揭示瘢痕疙瘩形成的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

miR-96-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其高表達(dá)量與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[11]。研究表明miR-96-5p通過靶向FOXO3促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[12]。相關(guān)報(bào)道指出miR-96-5p通過抑制Caveolae1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[13]。本研究結(jié)果顯示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-96-5p的表達(dá)水平顯著升高，提示miR-96-5p表達(dá)量升高可能促進(jìn)瘢痕疙瘩形成。本研究進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示抑制miR-96-5p的表達(dá)后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示抑制miR-96-5p的表達(dá)可通過抑制成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制瘢痕疙瘩形成。研究表明CyclinD1是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白，增生瘢痕中CyclinD1的表達(dá)量升高并可通過與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(CDK4/6)結(jié)合形成復(fù)合物從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。相關(guān)報(bào)道指出caspase-3是caspase家族主要成員，其可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)而阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制及修復(fù)進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-96-5p的表達(dá)后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)下調(diào)，C-caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示抑制miR-96-5p的表達(dá)可能通過促進(jìn)C-caspase-3表達(dá)及抑制CyclinD1表達(dá)從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

FOXO4低表達(dá)量與膀胱癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[16]。研究表明FOXO4表達(dá)量降低可參與肝癌的發(fā)生[17]。miR-150通過靶向FOXO4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長[18]。本研究結(jié)果顯示FOXO4在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步研究顯示上調(diào)FOXO4的表達(dá)后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，C-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示FOXO4過表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖。本研究顯示，miR-96-5p可靶向結(jié)合FOXO4并負(fù)向調(diào)控FOXO4的表達(dá)，抑制FOXO4的表達(dá)聯(lián)合抑制miR-96-5p表達(dá)處理成纖維細(xì)胞，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，CyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯升高，C-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明抑制FOXO4表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-96-5p表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響。提示抑制miR-96-5p表達(dá)可通過上調(diào)FOXO4表達(dá)從而影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)

胞增殖及凋亡。

綜上所述，miR-96-5p可能通過下調(diào)FOXO4的表達(dá)從而促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，為揭示瘢痕疙瘩形成機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為以miR-96-5p為靶點(diǎn)的瘢痕疙瘩的防治提供理論依據(jù)。但關(guān)于miR-96-5p在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)的相關(guān)信號通路尚需進(jìn)一步研究。