謝博文,盧春
(1.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.武漢市漢陽(yáng)醫(yī)院,湖北 武漢 430050)
目前,肺結(jié)核仍然是危害人類身體健康的常見(jiàn)慢性呼吸道傳染性疾病之一,結(jié)核分枝桿菌是其主要致病菌。盡管現(xiàn)在醫(yī)療水平迅速發(fā)展,而我國(guó)的肺結(jié)核發(fā)病率仍處世界前幾位。因此,控制其發(fā)病率關(guān)鍵要做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療[1]。臨床上除了結(jié)合肺結(jié)核的臨床癥狀及體征外,還有常規(guī)影像學(xué)檢查手段包括胸部平片、CT等,而肺結(jié)核的確診主要依靠痰培養(yǎng)及涂片學(xué)檢查,但因結(jié)核桿菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng),痰培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)及痰涂片檢出率低等缺點(diǎn),使部分肺結(jié)核患者痰檢陰性,造成肺結(jié)核患者的漏診、誤診等。除了確診肺結(jié)核的痰培養(yǎng)及痰涂片等實(shí)驗(yàn)室檢查外,最近在分子生物學(xué)及免疫學(xué)方面均有新的診療技術(shù)[2]。在所有肺結(jié)核類型中菌陰肺結(jié)核約占一半以上,故對(duì)其作出正確診斷及治療極為重要[3]。菌陰肺結(jié)核是指經(jīng)痰涂片分枝桿菌及痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核,故常常容易忽略[4]。近年來(lái),結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB),結(jié)核桿菌DNA(TB-DNA)及結(jié)核桿菌RNA(TB-RNA)試驗(yàn)是作為診斷肺結(jié)核很好的實(shí)驗(yàn)室檢查手段。T-SPOT.TB是在全血中通過(guò)定量檢測(cè)結(jié)核特異性抗原CFP-10及ESAT-6刺激下所釋放出的γ-INF的T淋巴細(xì)胞數(shù)目來(lái)用于診斷結(jié)核病[5-6],TB-DNA則是以PCR技術(shù)用于病原體的核酸診斷,而TB-RNA的檢測(cè)主要以病原體RNA 為擴(kuò)增靶標(biāo)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)(SAT)技術(shù)。本文主要行T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)與單用檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析,從而探討T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰性肺結(jié)核的診斷價(jià)值。
1.1 一般資料。選擇自2018年1月至2020年1月期間我院住院或門診期間經(jīng)痰涂片或痰培養(yǎng)確診為菌陰肺結(jié)核的191例患者,其中男115例,女76例,平均年齡(43.76±4.34)歲;同期選取113例非結(jié)核疾病患者作為對(duì)照組,其中男74例,女39例,平均年齡(40.45±3.15)歲;兩組患者間相關(guān)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。
1.1.1 初治菌陰肺結(jié)核組:即1次痰培養(yǎng)檢查及3次痰涂片檢查均為陰性的肺結(jié)核;所有191例菌陰性肺結(jié)核病例均符合2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。
1.1.2 非結(jié)核疾病組:經(jīng)各項(xiàng)檢查明確排除結(jié)核類疾病的113例患者,其中上呼吸道感染67例、肺炎22例、支氣管擴(kuò)張5例、慢性阻塞性肺疾病9例、肺癌1例,其他疾病9例。
1.2 檢測(cè)方法
1.2.1 SAT檢測(cè)TB-RNA:取痰液標(biāo)本于離心機(jī)離心4 min,棄去上清;后置于2 mL 0.9%Nacl洗滌棄去上清液;加入60 uL TB液再次洗滌稀釋后,于300 W超聲波處理15 min后,再次離心10 min;取2 uL上述清液于30uL擴(kuò)增管中;置于50℃恒溫儀器中保溫15 min;調(diào)至40℃中再次保溫5 min;然后每支反應(yīng)管加10 uL SAT 酶液,混合均勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至熒光定量PCR儀中;熒光檢測(cè)通道設(shè)定為FAM;40℃,50個(gè)循環(huán),共1 min;熒光信號(hào)采集60 s一次,共40次;根據(jù)CT值判斷結(jié)果。SAT試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供,儀器規(guī)格為ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀;
1.2.2 PCR檢測(cè)TB-DNA:取痰液標(biāo)本于等體積4%NaOH,搖勻,常溫靜置30 min左右,取1 mL離心6 min后棄去上清液;加入DNA提取液;于100℃恒溫箱中維持15 min;取2 uL置于PCR試管中;置于熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增;按試劑說(shuō)明書設(shè)定PCR 儀參數(shù);根據(jù)CT值計(jì)算TB-DNA含量;TB-DNA 試劑為英國(guó)Oxford Immunotec公司提供的晶芯分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒。熒光定量PCR儀由杭州博日科技有限公司的提供的檢測(cè)系統(tǒng)Bioer LineGene 9620。
1.2.3 T-SPOT.TB檢測(cè)方法:使用T-SPOT.TB方法(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)檢測(cè),靜脈采集4mL外周血液并進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分離;細(xì)胞洗滌干凈后將其濃度設(shè)置為250萬(wàn)/mL;參照T-SPOT.TB試劑盒說(shuō)明書并利用酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每個(gè)專用微孔板內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)量;陰性斑點(diǎn)數(shù)為0-5個(gè)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為:①抗原A 和抗原B 檢測(cè)孔計(jì)數(shù)-陰性孔計(jì)數(shù)≥6;②陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6,檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)。試劑盒由深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析;符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,方差齊的計(jì)量資料,兩組間比較采用單獨(dú)樣本t檢驗(yàn),方差不齊的計(jì)量資料,兩組間比較采用t′檢驗(yàn);靈敏度及特異度等指標(biāo)比較采用χ2檢驗(yàn);以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組一般資料比較。菌陰肺結(jié)核組、非結(jié)核疾病組兩組間年齡、性別構(gòu)成體及質(zhì)量構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。
表1 兩組研究對(duì)象基線特征的比較
2.2 3種檢測(cè)方法的敏感度及特異度。T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA試驗(yàn)對(duì)初治菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性率(敏感度)分別為94.8%,49.2%,63.4%;T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA試驗(yàn)對(duì)非結(jié)核疾病對(duì)照組的陰性率(特異度)分別為98.2%,95.6%,93.8%;可見(jiàn)T-SPOT.TB檢測(cè)方法對(duì)初治菌陰肺結(jié)核的敏感性及特異性均顯著;詳見(jiàn)表2。
表2 3項(xiàng)檢測(cè)方法的敏感性及特異性
2.3 三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性檢出率。含T-SPOT.TB的2聯(lián)對(duì)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性檢出率為93.7%;不含T-SPOT.TB的2聯(lián)對(duì)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性檢出率為84.1%;3聯(lián)檢測(cè)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性率為98.5%;可見(jiàn)含T-SPOT.TB的2聯(lián)陽(yáng)性檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的2聯(lián)檢出率(P<0.05);3聯(lián)陽(yáng)性檢出率明顯高于2聯(lián)檢出率(P<0.01),詳見(jiàn)表3。
表3 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核組的陽(yáng)性檢出率
雖然痰培養(yǎng)及涂片均能有效確診肺結(jié)核,目前臨床已廣泛運(yùn)用,但其缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期長(zhǎng),使多數(shù)患者不能立即確診,另外非活動(dòng)性結(jié)核患者處于潛伏期感染以及陳舊性肺結(jié)核的存在,這給此部分患者帶來(lái)的誤診率極高[7]。然而,隨著醫(yī)療的發(fā)展,一些新型檢查技術(shù)不斷涌現(xiàn),其中作為早期診斷肺結(jié)核疾病的實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)如T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA等已在某些醫(yī)院廣泛運(yùn)用,但三者對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷的敏感性及特異性方面報(bào)道各存差異。
PCR技術(shù)是目前臨床上較為流行的實(shí)驗(yàn)室檢查手段,而TB-DNA作為結(jié)核分枝桿菌的遺傳物質(zhì),因此可通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)TB-DNA水平,故可以用于衡量感染的結(jié)核桿菌嚴(yán)重程度[8]。但由于受實(shí)驗(yàn)室、試劑、標(biāo)本等污染因素影響,且在PCR擴(kuò)增過(guò)程中判定錯(cuò)誤等均使結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性[9]。目前利用SAT 技術(shù)檢測(cè)TB-RNA已用于臨床檢測(cè)結(jié)核病[10],通過(guò)以結(jié)核分枝桿菌RNA為擴(kuò)增靶點(diǎn),對(duì)產(chǎn)物RNA進(jìn)行靶向檢測(cè),故TB-RNA技術(shù)可以用于活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷及治療檢測(cè),但其特異性及敏感性尚待于研究.。雖然TB-DNA、TB-RNA在檢測(cè)結(jié)核病中均顯優(yōu)勢(shì),但其特異性及敏感性均不及T-SPOT.TB顯著,而本研究結(jié)果亦證實(shí)T-SPOT.TB在檢測(cè)菌陰肺結(jié)核方面優(yōu)于以上兩種檢測(cè)手段,結(jié)果亦表明含有T-SPOT.TB的二聯(lián)檢測(cè)手段對(duì)菌陰肺結(jié)核的檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的檢出率。
T-SPOT.TB技術(shù)是2001年由Dogra[11]等提出,提取經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中特異性活化的T細(xì)胞,后者在受到結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后分泌干擾素-γ而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞試驗(yàn),從而通過(guò)斑點(diǎn)數(shù)來(lái)推測(cè)體內(nèi)是否存在對(duì)結(jié)核桿菌反應(yīng)的T細(xì)胞用于結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷[12]。本研究表明,T-SPOT.TB在菌陰肺結(jié)核檢測(cè)的敏感性為94.8%,特異性為98.2%,顯著優(yōu)于TB-DNA和TB-RNA兩種檢測(cè)方法,此與浦永蘭等[13]表明T-SPOT.TB在菌陰肺結(jié)核組中的敏感性及特異性分別為89.6%和91.1%相接近。本研究顯示,結(jié)合TB-DNA、TB-RNA,三者聯(lián)合檢測(cè)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性率為98.5%;可見(jiàn)含T-SPOT.TB的2聯(lián)陽(yáng)性檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的2聯(lián)檢出率(P<0.05);3聯(lián)陽(yáng)性檢出率明顯高于2聯(lián)檢出率(P<0.01);另外,T-SPOT.TB檢測(cè)不受是否排菌、排菌數(shù)量以及排菌類型的影響,故在臨床檢測(cè)中較為準(zhǔn)確及快速,對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷意義重大,可以作為結(jié)核病早期快速診斷的有效手段。但其缺點(diǎn)在于無(wú)法區(qū)分死活菌及非結(jié)核分枝桿菌類型,這無(wú)疑降低其特異性[14]。
綜上可知,T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA三種方法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性檢出率顯著高于單獨(dú)檢測(cè)率。因此,在今后臨床中推薦三聯(lián)檢測(cè)菌陰肺結(jié)核方案極大提高其檢出率,使漏診率大大降低,值得臨床推廣。