解郁升陽通竅方對慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜保護作用的研究

戴敏，亢澤峰，褚文麗，胡竹林，鄭志坤，李妍

青光眼是當(dāng)今世界上主要的致盲性眼病之一。通過藥物或手術(shù)降低眼壓是治療青光眼的唯一有效措施，對于延緩青光眼的病程有明顯效果。然而，單純降眼壓治療并不能從根本上解決視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）死亡引起的視功能損害[1-2]。RGCs 的病理改變和凋亡在青光眼的發(fā)病過程中起著重要的作用，如何有效的保護視網(wǎng)膜及RGCs，對于青光眼的治療具有重要意義。目前，西醫(yī)在青光眼的視神經(jīng)保護方面一直沒有突破性進展，中醫(yī)藥臨床應(yīng)用歷史悠久，治療青光眼有其獨到之處。大量的實驗與臨床研究[3-6]顯示，中醫(yī)藥治療不僅能夠降低眼壓，而且在青光眼視神經(jīng)保護、視功能改善等方面具有很大的潛力和優(yōu)勢。本研究采用中醫(yī)眼科專家亢澤峰教授在臨床應(yīng)用于青光眼患者視神經(jīng)保護治療的經(jīng)驗方——解郁升陽通竅方（Jieyu Shengyang Tongqiao formula，JSTF）對慢性高眼壓兔進行干預(yù)，觀察其對視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及RGCs 的保護作用。從而為JSTF 在青光眼的臨床應(yīng)用提供一定實驗研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級成年新西蘭大白兔（36 只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg），由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供（動物許可證號：SYXK（滇）K2015-0002），實驗動物的飼養(yǎng)和使用符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。實驗動物倫理審批號：KPRC-IACUC17008。

1.2 試劑與儀器

將150 mg 卡波姆-940（索萊寶公司）和1.25 mg地塞米松（索萊寶公司）配制成含0.025%地塞米松的0.3%復(fù)方卡波姆溶液50 ml，pH 值為4.0，高壓滅菌，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。配?%戊巴比妥鈉溶液（戊巴比妥鈉，德國默克公司），過濾除菌，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥公司），兔抗人Caspase-3 多克隆抗體（美國genetex 公司），蘇木素-伊紅染色實驗相關(guān)試劑由云南省第二人民醫(yī)院病理科提供；Tono-pen XL 筆式眼壓計（美國Mentor 公司）。

1.3 實驗藥物

JSTF 藥物組成：生黃芪50 g、當(dāng)歸尾9 g、柴胡9 g、枳實9 g、生白芍9 g、青皮6 g、郁金9 g、枸杞子12 g、石斛12 g、升麻6 g、冰片0.6 g（用酒溶化）。中藥由云南省第二人民醫(yī)院提供，中藥浸膏由云南中醫(yī)藥大學(xué)制備。

1.4 方法

1.4.1 慢性高眼壓模型的建立 兔耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉20 mg/kg 麻醉動物，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼局部麻醉。右眼為正常眼，左眼為實驗眼。每眼均在1 ml 注射器角膜緣穿刺抽取0.1 ml房水后，正常組注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml，高眼壓模型組及各中藥治療組前房內(nèi)注射0.3%復(fù)方卡波姆溶液0.1 ml。慢性高眼壓模型以眼壓升高大于22 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），并能持續(xù)1 周為標(biāo)準(zhǔn)[7]。模型組及中藥治療組如眼壓<22 mm Hg，7 d后按上述方法重復(fù)注藥1 次。

1.4.2 動物分組與處理 造模前用裂隙燈、顯微鏡、眼底鏡檢查眼前節(jié)及眼底無異常，Tono-pen XL 筆式眼壓計連續(xù)測量眼壓3 d，每日1 次，眼壓＜17 mm Hg[8]的兔子方可采用。隨機分為正常組（NG），模型組（MG），高、中、低濃度JSTF 治療組（HCG、MCG、LCG）共5 組，每組6 只；另外還有6 只分別為建立高眼壓模型1周組3 只，高眼壓模型2 周組3 只。每日監(jiān)測術(shù)眼眼壓并觀察眼前節(jié)變化，造模后1 個月處死動物，摘除眼球，觀察相應(yīng)指標(biāo)。

JSTF 中藥灌服：按照不同種實驗動物間用藥量換算方法[7]換算得到不同濃度JSTF 治療組兔需灌服中藥量（低濃度JSTF 治療組：1.67 g·kg-1，中濃度JSTF治療組：5.02 g·kg-1，高濃度JSTF 治療組：15.06 g·kg-1）。造模成功后第1 d 開始給藥，中藥治療組每日予JSTF 灌服；模型組以中濃度JSTF 治療組等體積蒸餾水灌服；正常組不做處理，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 蘇木素-伊紅染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化

在模型建立后不同時間點（1 周、2 周、1 個月）及不同濃度中藥治療后，耳緣靜脈注射空氣處死動物，沿角膜緣剪開球結(jié)膜，分離眼球。將眼球置于40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，脫水后加入適量包埋劑，制成石蠟切片。蒸餾水沖洗，蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗，10g·L-1鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅復(fù)染2～5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察眼球組織形態(tài)變化，并在顯微鏡下選取視盤周圍5 mm 內(nèi)的視網(wǎng)膜標(biāo)本，置于400 倍顯微鏡下進行觀察拍照，用10×10 目網(wǎng)格（1 mm2）計算10 個方格中RGCs 數(shù)量，每只眼計數(shù)3 張切片，每張切片取3 個視野，取平均值。

1.6 視網(wǎng)膜神經(jīng)元Caspase-3 蛋白表達的檢測

采用免疫熒光染色法，將眼球置于4%多聚甲醛固定2 h，之后去除眼前節(jié)組織繼續(xù)固定24 h。30%蔗糖溶液脫水后加入冰凍包埋劑，制成冰凍切片。4%多聚甲醛固定30 min，1%TritonX-100 作用15 min，增加細胞膜的通透性，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30 min，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育l h，洗去多余的二抗，DAPI染核，最后用抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞漿呈紅色熒光為陽性細胞。用image pro plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析，對染色陽性物質(zhì)進行熒光強度測定，在200 倍光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機選取5 個視野，計算平均熒光強度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，多組間的兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓

注入0.3%復(fù)方卡波姆溶液后，兔眼壓逐漸升高，3 d 后開始穩(wěn)定升高，至模型建立1 個月后眼壓仍可以維持在較高水平。造模后1 個月，各組間眼壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=129.200，P=0.000）。與正常組比較，其他4 組眼壓均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tMG=15.950，tLCG=20.950，tMCG=20.900，tHCG=15.230，均P=0.000）。與模型組比較，各JSTF 治療組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 5 組眼壓比較（，mm Hg，n=6）

表1 5 組眼壓比較（，mm Hg，n=6）

注：* 與正常組比較，P＜0.05。JSTF 解郁升陽通竅方

2.2 眼前節(jié)的變化情況

造模后第1 d，角膜透明，角膜緣血管開始出現(xiàn)充血。隨著造模時間延長，兔眼球結(jié)膜混合充血，角膜緣血管迂曲、擴張，角膜水腫，前房加深，瞳孔偏大。造模后1 周，部分兔眼前房出現(xiàn)灰白色團塊狀滲出，之后逐漸吸收。隨著高眼壓模型建立時間延長至1 個月時，兔眼結(jié)膜充血減輕，角膜緣血管迂曲擴張程度及角膜水腫也逐漸減輕（圖1）。

圖1 慢性高眼壓模型兔的眼前節(jié)改變。1A 造模前；1B 造模后第1 d；1C 造模后1 周；1D 造模后2 周；1E 造模后1 個月

2.3 視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化

造模前視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維排列整齊緊密，RGCs 排列緊密，細胞體積一般較大，邊緣清楚，核呈圓形或略呈卵圓形，部分有明顯核仁。造模后1 周，可見RGCs 部分消失，內(nèi)核層神經(jīng)細胞減少，可見空泡，視網(wǎng)膜開始變薄。之后隨高眼壓時間延長，RGCs 及內(nèi)核層神經(jīng)細胞進一步減少，視網(wǎng)膜進一步變薄。造模后1 個月，內(nèi)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，RGCs 及內(nèi)核層神經(jīng)細胞大量丟失，視網(wǎng)膜明顯變?。▓D2）。

圖2 高眼壓模型建立不同時間點兔視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化（×400）。2A 造模前；2B 造模后1 周；2C 造模后2 周；2D 造模后1 個月

造模后1 個月，采用不同濃度JSTF 治療的模型兔眼內(nèi)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂減輕，RGCs 及內(nèi)核層神經(jīng)細胞數(shù)量增多，視網(wǎng)膜變薄程度減輕（圖3）。

圖3 造模后1 個月各組視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化（×400）。3A 正常組；3B 模型組；3C 低濃度JSTF治療組；3D 中濃度JSTF治療組；3E 高濃度JSTF治療組；JSTF 解郁升陽通竅方

2.4 視網(wǎng)膜RGCs 計數(shù)

造模后1 個月，5 組間RGCs 計數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3031.000，P=0.000）。與正常組相比，其他4 組RGCs 數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tMG=164.800，tLCG=101.400，tMCG=64.190，tHCG=47.100，均P=0.000）；與模型組比較，不同濃度JSTF 治療組RGCs 數(shù)量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tLCG=27.950，tMCG=53.790，tHCG=43.320，均P=0.000）；與低濃度JSTF治療組相比，中、高濃度JSTF 治療組RGCs 數(shù)量增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tMCG=24.760，tHCG=22.410，均P=0.000）；與中濃度JSTF 治療組相比，高濃度JSTF治療組RGCs 數(shù)量升高不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 5 組視網(wǎng)膜RGCs 計數(shù)比較（，個/10 mm2，n=6）

表2 5 組視網(wǎng)膜RGCs 計數(shù)比較（，個/10 mm2，n=6）

注：* 與正常組相比，P＜0.05；# 與模型組相比，P＜0.05；&與低濃度JSTF 治療組相比，P＜0.05。RGCs 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；JSTF 解郁升陽通竅方

2.5 視網(wǎng)膜Caspase-3 蛋白表達變化

根據(jù)2.4 所獲得的結(jié)果，選擇中濃度JSTF 對慢性高眼壓模型兔進行治療后，觀察Caspase-3 蛋白表達變化。正常組、模型組及中濃度JSTF 治療組均可見Caspase-3 蛋白陽性表達，表現(xiàn)為各層視網(wǎng)膜神經(jīng)元胞漿紅色熒光（圖4）。正常組Caspase-3 蛋白僅有少量表達，中濃度JSTF 治療組及模型組Caspase-3 蛋白熒光強度均較正常組明顯增高（tMCG=79.470，tMG=19.820，均P=0.000），中濃度JSTF 治療組Caspase-3 蛋白熒光強度較模型組降低（t=44.510，P=0.000）（表3）。

圖4 造模后1 個月各層視網(wǎng)膜神經(jīng)元Caspase-3 蛋白表達變化（×200）。紅色熒光代表Caspase-3 蛋白的陽性表達；藍色熒光代表DAPI 染色的視網(wǎng)膜各層細胞核；DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge Caspase-3 與DAPI 染色的合成圖；JSTF 解郁升陽通竅方

表3 3 組各層視網(wǎng)膜神經(jīng)元Caspase-3 蛋白表達比較（，n=6）

表3 3 組各層視網(wǎng)膜神經(jīng)元Caspase-3 蛋白表達比較（，n=6）

注：* 與正常組相比，P＜0.05；# 與模型組相比，P＜0.05。JSTF 解郁升陽通竅方

3 討論

目前青光眼的病情進展仍然是以降眼壓來控制。然而，控制眼壓并不是唯一治療目標(biāo)。早期有效地進行視神經(jīng)、視網(wǎng)膜的保護，減少RGCs 的凋亡，保護患者的視功能是治療青光眼的最終目的。然而青光眼視神經(jīng)保護的藥物療效存在一定的局限性。中醫(yī)中藥具有整體觀念和辨證論治的治療特色，其通過調(diào)節(jié)全身的臟腑、經(jīng)絡(luò)及精氣血津液以改善機體的微環(huán)境，在保護視神經(jīng)方面具有一定優(yōu)勢?？簼煞褰淌谡J為肝腎虛損、脈絡(luò)瘀滯是青光眼視神經(jīng)損害的主要病機，故以“解郁開竅，升陽明目”作為青光眼視神經(jīng)保護的首要治則。通過長期臨床實踐，總結(jié)并創(chuàng)立了青光眼視神經(jīng)保護經(jīng)驗方“解郁升陽通竅方”。方中以黃芪、柴胡共為君藥，益氣健脾，疏肝解郁，升舉陽氣；當(dāng)歸具有補血活血之功，合黃芪可達補氣生血、養(yǎng)血潤目之效，白芍養(yǎng)血斂陰柔肝，合柴胡可達補血養(yǎng)肝，條達肝氣之功，兩者皆為臣藥；枳實、青皮、郁金共奏疏肝理氣、解郁開竅之功，枸杞子合石斛滋補肝腎、益精明目，共為佐藥；后以升麻升舉陽氣、載藥上行，冰片開竅解郁、引藥上行為使。諸藥共奏解郁開竅，升陽明目之功。

為進一步探討JSTF 改善患者視功能的機制，課題組采用慢性高眼壓兔來進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，不同濃度JSTF 治療組的眼壓與模型組無明顯差異，說明JSTF 并無降眼壓的作用。采用不同濃度JSTF 治療后1 個月，兔眼內(nèi)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂減輕，視網(wǎng)膜變薄程度減輕，RGCs 數(shù)量也較模型組增多。說明JSTF 對慢性高眼壓兔視網(wǎng)膜及RGCs 具有保護作用。Caspase 蛋白酶在哺乳動物細胞中介導(dǎo)凋亡，是觸發(fā)細胞凋亡的關(guān)鍵酶[9-10]，有研究[11]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在細胞凋亡中有著重要作用?；钚匝醯漠a(chǎn)生能夠激活Caspase-3，激活Caspase 依賴性細胞凋亡，在觸發(fā)神經(jīng)元死亡中起關(guān)鍵作用[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，正常組Caspase-3 蛋白僅有少量表達，JSTF 治療組及高眼壓模型組Caspase-3 蛋白熒光強度均較正常組增高，而JSTF 治療組Caspase-3 蛋白熒光強度較模型組降低。說明JSTF 對慢性高眼壓兔RGCs 的保護作用可能與其能夠抑制Caspase-3 的表達、減少RGCs 的凋亡有關(guān)。

本研究為JSTF 對青光眼患者視網(wǎng)膜及RGCs的保護作用提供了實驗基礎(chǔ)，為中藥方劑對改善青光眼患者視功能的有效性提供了可靠依據(jù)。然而，JSTF 通過何種途徑抑制Caspase-3 的表達以及如何減輕視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂的具體機制仍需在以后的研究中進一步探索。