褪黑素對AFB1所致大鼠心肌損傷作用及機制

閆慧,徐慶科,高洪瑞,潘洋,郝巖,李健

(青島大學附屬醫(yī)院心內科,山東 青島 266003)

黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生[1]。作為迄今為止人類所知的毒性最強的食品污染物之一,黃曲霉毒素B1(AFB1)進入人體后,可誘導組織損傷[2]。AFB1誘導組織損傷的機制十分復雜,其中氧化應激被認為是其產生毒性的重要基礎[3]。氧化應激是凋亡的重要調節(jié)信號[4]。凋亡又稱為程序性細胞死亡,是一種細胞自主性自身破壞的死亡形式,可引起細胞形態(tài)改變、DNA 斷裂和凋亡小體形成[5-6]。WANG 等[7]研究表明,AFB1 可誘導產生過量的活性氧(ROS),觸發(fā)氧化應激并誘導心肌細胞凋亡。因此,有必要找到安全有效的天然抗氧化劑,以預防或減輕AFB1誘導的心肌損傷。褪黑素(MT)是一種由松果體分泌的神經內分泌激素,具有調節(jié)生物節(jié)律、抗氧化的作用[8-9]。MT 可以很容易地進入細胞和亞細胞區(qū)室,從而在減輕氧化應激方面優(yōu)于其他抗氧化劑[10]。近年來的研究表明,MT 對由氧化應激水平升高誘發(fā)的多種心臟疾病均具有治療作用,如心肌缺血/再灌注性損傷、糖尿病性心肌病等[11-12]。但關于MT 干預黃曲霉毒素誘發(fā)的心肌損傷少見報道。因此,本研究構建AFB1所致大鼠心肌損傷模型,并給予MT 干預,探討MT 對AFB1心肌毒性的改善作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

成年雄性健康SD大鼠,體質量約150 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證號為SCXK(魯)20140007。MT 為Sigma公司產品;AFB1購于上海誠竺生物科技有限公司;抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體和抗β-action抗體均由美國Abcam 公司提供;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)以及TUNEL試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶-MB(CK-MB)試劑盒為南京建成生物工程研究所產品;DAB染色液由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;BCA 試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 適應性喂養(yǎng)1周后,將大鼠將隨機分為對照組(A 組)、AFB1 組(B 組)和AFB1+MT 組(C 組),每 組5 只。AFB1+MT 組大鼠給予MT 溶液(5 mg/kg,溶于乙醇生理鹽水中)每天1次灌胃,與此同時對照組和AFB1組大鼠給予等量的乙醇生理鹽水灌胃。MT 給藥后半小時,AFB1組和AFB1+MT 組大鼠給予AFB1溶液(0.3 mg/kg)灌胃,對照組大鼠給予等量的含有二甲基亞砜的蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃6周。

1.2.2標本采集 連續(xù)6周胃插管給藥后,腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,腹主動脈取血并迅速取出心臟組織。大鼠心臟被分為3等份,分別接受如下處理:①立即制備心臟組織勻漿液,檢測SOD、CAT 和MDA 的水平;②在液氮中速凍并保存于-80 ℃冰箱中待進行蛋白質提取和分析;③用40 g/L甲醛固定備分析細胞凋亡。

1.2.3血清LDH、CK-MB 水平的測定 從大鼠的腹主動脈采集血樣,先在室溫下靜置30 min,再以3 000 r/min在4 ℃下離心10 min分離血清。根據(jù)試劑盒的說明,采用免疫抑制法測定血清CK-MB水平,采用微板法測定血清LDH 水平。實驗重復3次,取平均值。

1.2.4心臟組織MDA 含量和SOD、CAT 活性的測定 稱取新鮮大鼠心臟組織,制備100 g/L 勻漿液,在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。吸取上清液轉入新的EP管中,按照試劑盒說明書,利用各自的底物進行酶促反應并測量吸光度,計算心臟組織中MDA、SOD 和CAT 的表達水平。實驗重復3次,取平均值。

1.2.5Western blot檢測caspase-3 的表達 將100 mg的冷凍大鼠心臟組織置于1 L 含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液中充分裂解,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,收集上清液,提取組織總蛋白,采用BCA 法測蛋白濃度。應用125 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白(60 mg),轉膜,封閉,加入兔源一抗(caspase-3,1∶500;β-actin,1∶10 000),于4 ℃下孵育過夜,洗滌3次后在室溫下再加入HRP 標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育2 h。最后用TBST 洗滌3次,通過增強化學發(fā)光(ECL)法使目標條帶顯色,并使用Image J軟件分析其灰度值。目標蛋白的相對表達水平=目標蛋白條帶的灰度值/β-action條帶的灰度值。實驗重復3次,取平均值。

1.2.6TUNEL染色檢測細胞凋亡 每個樣本隨機取5張切片,用體積分數(shù)0.03的過氧化氫封閉后,按試劑盒說明書對心臟石蠟切片進行TUNEL 染色,以PBST 洗片,DAB 染色。在光鏡下觀察凋亡的心肌細胞(細胞核呈黃棕色者),應用Image-Pro Plus 6.0 軟件對細胞進行計數(shù)。計算凋亡率(凋亡細胞與每個區(qū)域中總細胞的百分比)。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所得結果以表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;兩個變量之間的相關性評估采用Pearson相關分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟損傷血清指標的比較

各組大鼠血清CK-MB、LDH 水平存在明顯差異(F=16.60、17.75,P＜0.01)。與對照組相比,AFB1組大鼠血清中心肌損傷標志物CK-MB 和LDH 的水平明顯升高(t=5.14、5.91,P＜0.01),而AFB1+MT 組大鼠的血清CK-MB、LDH 水 平較AFB1組顯著降低(t=3.06、3.61,P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷血清指標的比較(n=5,z/U·L-1,)

表1 各組大鼠心肌損傷血清指標的比較(n=5,z/U·L-1,)

與A 組相比,*t=5.14、5.91,P＜0.01;與B組相比,#t=3.06、3.61,P＜0.01。

2.2 各組大鼠心臟組織MDA 含量及SOD、CAT活性的比較

與對照組相比較,AFB1組大鼠心臟組織勻漿液中MDA 含量顯著升高,抗氧化酶SOD 和CAT的活性顯著降低;與AFB1組相比,AFB1+MT 組大鼠MDA 含量明顯下降,SOD 和CAT 的活性明顯升高,組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=5.63～17.12,t=2.44～5.50,P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌氧化應激指標的比較(n=5,)

表2 各組大鼠心肌氧化應激指標的比較(n=5,)

2.3 各組大鼠心臟組織caspase-3蛋白表達比較

Western blot檢測結果顯示,對照組、AFB1組和AFB1+MT 組心臟組織caspase-3 蛋白相對表達水平分別為1.00±0.25、3.45±0.70、2.07±0.76。AFB1組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達水平較對照組顯著增加(F=11.94,t=4.87,P＜0.01),AFB1+MT 組大鼠心臟組織caspase-3蛋白的表達顯著低于AFB1組(t=2.74,P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織caspase-3蛋白表達的Western blot檢測

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率的比較

TUNEL染色結果顯示,與對照組相比,AFB1組大鼠心肌細胞凋亡明顯增加(F=8.98,t=4.16,P＜0.01),但MT 預處理使心肌細胞的凋亡受到了抑制(t=2.29,P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織TUNEL染色

2.5 大鼠心臟組織中caspase-3與氧化應激指標的相關性

Pearson相關分析顯示,AFB1+MT 組大鼠心臟組織中caspase-3的表達水平與MDA 含量呈顯著正相關(r=0.857,P＜0.05),而與SOD 和CAT的酶活性呈顯著負相關(r=-0.845、-0.732,P＜0.05)。

3 討 論

AFB1是已知最危險的真菌毒素,攝入這種毒素能夠引起心臟損傷[13-14]。本研究采用AFB1溶液(0.3 mg·kg-1·d-1)灌胃構建大鼠心肌損傷模型,顯示AFB1組大鼠血清中心肌損傷標志物CK-MB和LDH 的水平明顯升高,說明大鼠心肌損傷模型制備成功;與AFB1 組相比,MT 給藥后AFB1+MT 組血清CK-MB、LDH 水平顯著降低。本研究結果首次證明,MT 的應用可以有效地挽救暴露于AFB1所致的心肌損傷。為明確MT 對AFB1引起的大鼠心肌損傷的保護作用及機制,本研究進一步檢測了各組大鼠的心臟氧化應激指標和心肌細胞凋亡程度。

相關研究表明,AFB1可誘導細胞產生大量的ROS,進一步破壞膜質和DNA 的結構,并抑制其修復而引起氧化應激[15-16]。正常情況下機體的氧化和抗氧化能力處于平衡狀態(tài),任何增強氧化作用或降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡,致細胞內ROS過量積累,進而引起細胞氧化損傷[17-18]。其中,脂質過氧化被認為是氧化損傷的主要指標之一,主要表現(xiàn)為MDA 含量的增加。MT 是目前已知的最為強效的抗氧化劑之一[19]。對大鼠肝臟的研究結果顯示,MT 可以顯著恢復谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、SOD 和谷胱甘肽轉移酶(GST)等抗氧化酶的活性,有效減輕AFB1誘導的肝臟氧化損傷[20-21]。這些抗氧化酶共同參與機體抗氧化防御系統(tǒng)的形成,其中,SOD 可催化氧自由基生成H2O2,進一步在GPx和CAT 的催化下分解為水和氧[22-23]。本研究結果顯示,經AFB1處理后,大鼠心臟組織勻漿液中MDA 的含量顯著升高,抗氧化酶SOD 和CAT的活性顯著降低,與以往的報道一致[13];AFB1+MT 組與AFB1組相比,MDA 含量明顯下降,組織抗氧化酶活性明顯升高,組間比較差異均有統(tǒng)計學意義,表明MT 通過增強組織抗氧化能力來減輕AFB1誘導的心臟氧化損傷。

我們的前期研究證實,AFB1引起的心臟損傷與心肌細胞的凋亡有關[24]。細胞凋亡過程需要多種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的參與,其中,caspase-3是凋亡執(zhí)行過程中最主要的蛋白,并在AFB1暴露的心肌細胞中異常表達,最終導致細胞的死亡[7,24]。氧化應激被認為是凋亡的重要調節(jié)信號[25]。線粒體功能障礙與氧化應激誘導的凋亡過程密切相關,線粒體通透性的增加導致細胞色素C 的釋放增多,胞質中游離的細胞色素C 可通過激活caspase-9而激活下游的caspase-3,最終導致凋亡的發(fā)生[26-28]。因此,氧化應激的抑制可能對AFB1誘導的心肌細胞凋亡具有保護作用。MEKI等[21]研究表明,MT通過改善氧化應激,下調caspase-3蛋白的表達,減輕AFB1誘導的肝細胞凋亡,從而保護肝臟組織免受AFB1的毒性損傷。目前,關于MT 對AFB1細胞毒性的保護作用的研究尚僅限于消化和生殖系統(tǒng)[29-30],而其與心臟有關的報道很少。

本研究TUNEL 染色顯示,AFB1可使大鼠心肌細胞凋亡率明顯增加,而給予MT 預處理則顯著抑制了AFB1 誘導的心肌細胞凋亡;Western blot檢測結果也顯示,MT 可以顯著降低AFB1誘導的caspase-3的活化,而caspase-3 是凋亡過程中的關鍵調控蛋白,說明MT 可能是通過下調caspase-3蛋白的表達來減輕AFB1的心肌毒性。進一步的相關分析顯示,大鼠心臟組織中caspase-3的表達水平與MDA 含量呈正相關,而與SOD 和CAT 的酶活性呈負相關。這些研究結果表明,MT 保護大鼠心臟免受AFB1的毒性損傷,其機制可能與抑制氧化應激、下調caspase-3的表達,進而減少心肌細胞的異常凋亡有關。

綜上所述,氧化應激是AFB1心肌毒性的主要表現(xiàn)之一,最終導致心肌細胞的凋亡。作為人類可自身分泌的內源性激素,MT 具有強大的抗氧化能力,且安全無毒性。本研究結果表明,MT 可以減輕AFB1誘導的心臟損傷,該作用可能是通過改善心肌抗氧化能力、抑制caspase-3蛋白的表達、降低心肌細胞凋亡實現(xiàn)的,這為AFB1心臟毒性的治療提供了新的方法。