沉默MAGI2基因?qū)θ榘┠退幖?xì)胞增殖與凋亡影響

李一,黃婷,楊麟瀚,吳池華

(四川省人民醫(yī)院(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)乳腺外科,四川 成都 610072)

乳癌是女性腫瘤中死亡率較高的癌癥之一,目前臨床上常采用手術(shù)切除、放化療等治療手段,但是仍會出現(xiàn)治療效果不佳、復(fù)發(fā)等不良情況[1-2]。阿霉素是化療常用的治療藥物之一,在化療過程中容易產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重影響病人的治療效果[3-6]。研究結(jié)果顯示,膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2(MAGI2)可通過結(jié)合于第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等[7]。MAGI2被證實(shí)在乳癌細(xì)胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但對乳癌耐藥細(xì)胞的研究相對較少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過檢測MAGI2在人乳癌細(xì)胞MCF-7及阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR 中的表達(dá)量,并通過小干擾RNA(siRNA)下調(diào)其MCF-7/ADR 細(xì)胞中的表達(dá)量,觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡的影響,為提高乳癌耐藥細(xì)胞的分子靶向治療效果提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳癌細(xì)胞MCF-7購自美國模式菌種收集中心,胎牛血清購自美國HyClone公司,DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自日本DOJINDO 公司;流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,siRNA NC質(zhì)粒、siRNA MAGI2質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,兔抗MAGI2、兔抗磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、兔抗絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)、兔抗磷酸化AKT(p-AKT)、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自美國Abcam 公司。流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀購自美國BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7及MCF-7/ADR 細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基中孵育,加入體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清。為維持MCF-7/ADR 細(xì)胞的耐藥性,額外在培養(yǎng)基中加入75 mg/L 阿霉素。培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃,每2 d更換1次培養(yǎng)基,加入胰蛋白酶按1∶3比例傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞,將其隨機(jī)分為si-NC 組、si-MAGI2組。si-NC組和si-MAGI2組根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將siRNA NC 質(zhì)粒和siRNAMAGI2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入MCF-7/ADR 細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3qPCR 實(shí)驗(yàn) 按照TRIzol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA,并檢測其濃度和純度,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c DNA,最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以GAPDH 作為內(nèi)參照,通過Bio-Rad PCR 系統(tǒng)分析MAGI2的表達(dá)水平。所用引物及其序列見表1。

表1 qPCR 引物及其序列

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集1×105個MCF-7/ADR細(xì)胞,根據(jù)1.2.2的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)48 h,接種至96孔板,分別培養(yǎng)24、48、72 h,每孔加入10μL的CCK-8工作液,孵育2～3 h,在酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測吸光度值(A 值)。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn) 收集MCF-7/ADR 細(xì)胞,加入RIPA 裂解液(含10 g/L的PMSF),4 ℃孵育30 min,提取細(xì)胞總蛋白,與適量緩沖液混勻,100 ℃變性10 min。吸取20μg蛋白依次加入上樣孔,通過100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,放置50 g/L 封閉液孵育1 h,將PVDF 膜轉(zhuǎn)移至裝有加入MAGI2抗體(1∶1 000)、PI3K(1∶2 000)、AKT(1∶10 000)、p-PI3K(1∶5 000)、p-AKT(1∶1 000)溶液中,4 ℃過夜,加入二抗(1∶5 000)孵育60 min,顯影、曝光,比較MAGI2 和GAPDH 蛋白灰度值比值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 收集MCF-7/ADR 細(xì)胞,加200μL 磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC/碘化丙啶工作液,37 ℃孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測其凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料結(jié)果以表示,兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 MAGI2 在MCF-7及MCF-7/ADR 細(xì)胞表達(dá)

MAGI2在MCF-7 和MCF-7/ADR 細(xì)胞中的表達(dá)量分別為1.000±0.075 和2.136±0.118。與MCF-7細(xì)胞相比,MAGI2在MCF-7/ADR 細(xì)胞中的表達(dá)量增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.902,P＜0.05)。見圖1。

圖1 MAGI2 在MCF-7以及MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)比較

2.2 沉默MAGI2 對MCF-7/ADR 細(xì)胞MAGI2蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖影響

與si-NC 組相比,si-MAGI2組MCF-7/ADR細(xì)胞中MAGI2蛋白表達(dá)量明顯降低,差異有顯著性(t=20.175,P＜0.05);si-MAGI2組MCF-7/ADR 細(xì)胞增殖明顯抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.129～6.167,P＜0.05)。見圖2、表2。

表2 沉默MAGI2 對MCF-7/ADR 細(xì)胞增殖的影響(n=6,)

表2 沉默MAGI2 對MCF-7/ADR 細(xì)胞增殖的影響(n=6,)

與si-NC組相比,*t=2.129～20.175,P＜0.05。

圖2 轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADR細(xì)胞中MAGI2蛋白表達(dá)量

2.3 沉默MAGI2 對MCF-7/ADR 細(xì)胞凋亡影響

si-NC組和si-MAGI2組MCF-7/ADR 細(xì)胞的凋亡率分別為(5.236±0.479)% 和(27.423±2.152)%。與si-NC 組相比,沉默MAGI2可促進(jìn)MCF-7/ADR 細(xì)胞凋亡,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.651,P＜0.05)。

2.4 沉默MAGI2 對PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

結(jié)果顯示,與si-NC 組相比,沉默MAGI2對MCF-7/ADR 細(xì)胞中總PI3K 蛋白水平及總AKT蛋白水平均無明顯影響,但可明顯降低p-PI3K 蛋白和p-AKT 蛋白的表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.266、19.117,P＜0.05)。見圖3、表3。

圖3 沉默MAGI2 對PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

表3 沉默MAGI2 對PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響(n=6,)

表3 沉默MAGI2 對PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響(n=6,)

與si-NC組相比,*t=18.266、19.117,P＜0.05。

3 討 論

乳癌是一種女性常見惡性腫瘤[8-9]。化療是一種常用的乳癌治療手段,其中阿霉素是臨床常用的化療藥物[10-11]。MAGI2是膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族的成員之一,含有1 227個氨基酸殘基,具有多個結(jié)構(gòu)域,能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合從而參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過程。近年來的研究證實(shí),MAGI2參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。例如,MAGI2在胰腺癌組織中表達(dá)量異常,與臨床病理特征如分期、復(fù)發(fā)等相關(guān)[12]。有研究表明,MAGI2可作為miR-487a的靶基因參與乳癌細(xì)胞的侵襲、遷移、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程,在乳癌組織生長以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13],這說明MAGI2可以作為乳癌臨床診斷的潛在標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,MAGI2蛋白在MCF-7/ADR 細(xì)胞中較MCF-7 表達(dá)量上調(diào),而下調(diào)MAGI2蛋白表達(dá)水平可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡,表明MAGI2可通過促進(jìn)乳癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,增強(qiáng)其阿霉素耐藥性。

研究表明,MAGI2 含有與PTEN 蛋白具有高親和力的結(jié)構(gòu)域,通過特異性募集、結(jié)合于PTEN,促進(jìn)PTEN 蛋白的穩(wěn)定性表達(dá)[7],PTEN 可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,例如前列腺癌、口腔癌、乳癌等[14-16]。PTEN 主要通過影響PI3K/AKT 等信號通路的活性,參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性[17-20]。研究顯示,PI3K/AKT 可以參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等[21-22],影響多種腫瘤的病理進(jìn)展過程,如卵巢癌、結(jié)腸癌、乳癌等[23-24],與乳癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的耐藥性密切相關(guān)[25-28]。LI等[25]研究結(jié)果顯示,si-HOTAIR通過抑制PI3K/AKT/m TOR信號通路的表達(dá)降低乳癌細(xì)胞對阿霉素的抗性。本文研究結(jié)果顯示,下調(diào)MAGI2對總的PI3K 蛋白、AKT 蛋白水平均無顯著的影響,但可明顯降低p-PI3K 蛋白、p-AKT 蛋白水平,表明下調(diào)MAGI2可能是通過特異性結(jié)合于PTEN,進(jìn)而影響PI3K/AKT 信號通路的活化水平,從而調(diào)控乳癌細(xì)胞的耐藥性。

綜上所述,MAGI2基因在乳癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR 中表達(dá)量增加;下調(diào)MAGI2基因可能通過影響PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的活性水平,從而抑制耐藥細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,這為耐藥細(xì)胞的分子靶向治療提供理論依據(jù)。未來會進(jìn)一步在多株耐藥細(xì)胞系、動物模型以及臨床樣本中進(jìn)一步探究MAGI2調(diào)控乳癌細(xì)胞耐藥性的作用以及機(jī)制。