應(yīng)用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)過程探討——以乙型肝炎病毒表面抗原檢測為例

劉 麗，何 露，孔凡虹，曹敬麗，賈子琪，劉文松，許 震，王雅杰，3

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100050）

應(yīng)用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)過程探討——以乙型肝炎病毒表面抗原檢測為例

劉 麗1，何 露2，孔凡虹2，曹敬麗1，賈子琪2，劉文松2，許 震2，王雅杰1，3

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100050）

目的 利用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作流程，通過縮短孵育時(shí)間，以提高工作效率。方法 收集化學(xué)發(fā)光法定量檢測乙肝表面抗原陽性高值樣本30例、陽性中值樣本30例、陽性臨界值樣本30例、陰性樣本30例，使用ELISA試劑盒說明書推薦方法和快速孵育法同時(shí)進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果相關(guān)性。結(jié)果 使用酶標(biāo)板孵育器將孵育時(shí)間縮短至原來的1/2、1/3時(shí)，ELISA試劑盒說明書推薦方法、快速孵育法與化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果符合率100%；當(dāng)孵育時(shí)間縮短至原來時(shí)間的1/4時(shí)，兩種方法與化學(xué)發(fā)光法陰性、高值和中值樣本檢測結(jié)果符合率100%；臨界值樣本檢測時(shí)，ELISA試劑盒說明書推薦方法與化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果符合率100%，快速孵育法與化學(xué)發(fā)光法結(jié)果6例不一致，檢測結(jié)果符合率80%。結(jié)論 通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)時(shí)，快速孵育法可滿足臨床檢測，可將孵育時(shí)間縮短至原試劑盒推薦時(shí)間的1/3或1/2，可提高工作效率。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)； 快速孵育法

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是臨床實(shí)驗(yàn)室中最常使用的方法之一，是一種以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。ELISA技術(shù)操作簡易、成本低、數(shù)據(jù)可靠，在臨床和科研中均有比較廣泛的應(yīng)用［1］。本文利用ELISA技術(shù)進(jìn)行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）檢測，其主要實(shí)驗(yàn)步驟為加樣、抗原抗體孵育、洗滌、生物酶素孵育、洗滌、辣根過氧化酶二抗孵育、顯色、終止、酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。孵育是ELISA檢測中影響檢測成敗的最關(guān)鍵因素之一［2］，本文中ELISA實(shí)驗(yàn)過程涉及三次孵育，是耗時(shí)最長的實(shí)驗(yàn)步驟。酶標(biāo)板快速孵育器采用前期加溫造就一個(gè)孵育室高溫環(huán)境，使酶標(biāo)板與孵育室的溫差增大而快速升溫，以縮短孵育時(shí)間。本文通過利用快速孵育器孵育與ELISA試劑盒推薦方法、化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行臨床上常見指標(biāo)乙型肝炎病毒（簡稱乙肝）表面抗原的檢測，探討利用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作流程的可能性。

材料與方法

1 樣本來源

收集乙肝患者定量檢測乙肝表面抗原的血清樣本，其中大于試劑盒檢測上限（≥250 IU/mL）的高值樣本30例，男性14例，女性16例，年齡26～58歲，37.2±11.0歲；中值樣本（100～250 IU/mL）30例，其中24例男性，6例女性，年齡29～70歲，45.4± 2.0歲，實(shí)際檢測結(jié)果100.69～209.98IU/mL；低值樣本（0～100 IU/mL）30例，其中23例男性，7例女性，年齡26～69歲，48.0±12.4歲，實(shí)際檢測結(jié)果1.25～82.38 IU/mL；收集正常體檢樣本，乙肝表面抗原陰性樣本30例，其中11例男性，19例女性，年齡25～79歲，49.0±14.4歲。所有樣本 3000r/min離心10min，分裝于離心管中，存儲(chǔ)在-80℃冰箱中，用于ELISA說明書推薦方法、快速孵育法檢測，檢測時(shí)所有樣本隨機(jī)順序加樣。

2 儀器與試劑

2.1儀器 美國雅培Architect i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國MD酶標(biāo)儀，成都蓋森酶標(biāo)板快速孵育器，白洋離心機(jī)，美國RAININ移液器。

2.2試劑 化學(xué)發(fā)光法乙型肝炎病毒表面抗原定量測定試劑盒（美國雅培ARCHITECT公司），酶聯(lián)免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)有限公司）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg的方法（E法） 按照美國雅培ARCHITECT公司乙型肝炎病毒表面抗原定量測定試劑說明書操作，檢測前質(zhì)控結(jié)果在控。

3.2ELISA方法批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（精密度）

選用高、低兩個(gè)質(zhì)控品，使用ELISA方法進(jìn)行重復(fù)性檢測，每個(gè)質(zhì)控品連續(xù)重復(fù)測定20次，記錄S/CO值，計(jì)算變異系數(shù)（CV，%）。ELISA檢測時(shí)，試劑盒室溫平衡30min后進(jìn)行A、B、C、D四種實(shí)驗(yàn)方法檢測，其中A法按說明書使用常規(guī)方法進(jìn)行孵育，B、C、D法均使用酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行孵育，其中B法孵育時(shí)間選用原來1/2時(shí)間，C法孵育時(shí)間選用原來1/3時(shí)間，D法孵育時(shí)間選用原來1/4時(shí)間，具體孵育時(shí)間見表1，其他操作步驟嚴(yán)格遵守說明書進(jìn)行。

表1　不同方法ELISA實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間

3.3ELISA方法檢測 使用臨床收集樣本進(jìn)行ELISA檢測，樣本隨機(jī)順序加樣，ELISA檢測方法同3.2。記錄樣本S/CO的值（S/CO＜1為陰性，S/CO≥1為陽性）。

4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

A法與化學(xué)發(fā)光法（E法）進(jìn)行比較，B、C、D法再分別和A法進(jìn)行比較，分別計(jì)算臨界值樣本、陰性值樣本、陽性值樣本符合率。所有結(jié)果均使用S/CO值進(jìn)行計(jì)算，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性、陽性對(duì)照，根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)，陰性質(zhì)控結(jié)果吸光度值＜0.10、陽性質(zhì)控結(jié)果吸光度值＞0.80時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。實(shí)驗(yàn)中陰性質(zhì)控結(jié)果吸光度均值0.007，陽性質(zhì)控結(jié)果吸光度均值3.93，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

A法與E法檢測結(jié)果比較見表2。結(jié)果顯示，ELISA試劑盒推薦方法檢測結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法結(jié)果完全一致，與化學(xué)發(fā)光法比較方法無差異（P＞0.05）。

表2　A法與E法檢測HBsAg陰陽性情況

A、B、C、D法批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（精密度）判斷標(biāo)準(zhǔn)為說明書要求的精密度變異系數(shù)（CV，%）≤15%。精密度結(jié)果使用S/CO值進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精密度均在15%以內(nèi)。見表3。

表3　A、B、C、D法檢測HBsAg精密度結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表4至表6），用酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用北京萬泰生物藥業(yè)HBsAg診斷試劑盒，當(dāng)時(shí)間縮短為原來的1/2、1/3時(shí)，陰性陽性結(jié)果與A法完全一致（P＞0.05），敏感性100%，特異性100%，符合率100%；當(dāng)時(shí)間縮短為原來的1/4時(shí)，陰性結(jié)果完全一致，陽性結(jié)果有6例不符，且均在臨界值樣本，敏感性 93.3%，特異性 100%，樣本符合率80%，與A法有差異（P＜0.05）。

表4　A、B、C、D法檢測HBsAg陰陽性情況

表5　B、C、D法檢測HBsAg敏感性特異性情況

表6　B、C、D法檢測HBsAg陰陽性符合率情況

討論

ELISA檢測方法是臨床檢驗(yàn)最為常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，其操作簡便、成本低、特異性好、靈敏度高［3-4］，無需特殊儀器，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化。但是其操作時(shí)間長，孵育時(shí)間約占到實(shí)驗(yàn)總時(shí)間的一半，每天可檢測的數(shù)量有限。如果可以縮短實(shí)驗(yàn)流程將會(huì)提高工作效率。

本文乙肝表面抗原ELISA檢測方法的原理為雙抗體夾心法［5］，即先將抗體結(jié)合到某種固相載體表面，然后加入待測抗原樣本，再加入酶標(biāo)抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，最后加入底物進(jìn)行顯色，由于酶的催化效率很高，故可放大反應(yīng)效應(yīng)，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每一步抗原抗體的反應(yīng)均需要相應(yīng)的孵育，孵育時(shí)間合適才能使抗原抗體有效的結(jié)合，最終得到可信的結(jié)果。

常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)的孵育［6］都是在水浴鍋或者溫箱里進(jìn)行的，升溫曲線較慢，50～60min樣本溫度才能趨于37℃恒溫點(diǎn)，而且溫箱或水浴鍋存在受熱不均勻、溫度不準(zhǔn)確或ELISA反應(yīng)板周圍環(huán)境可達(dá)到預(yù)期溫度而孔內(nèi)溫度不能達(dá)到等問題。

酶標(biāo)板快速孵育器主要通過發(fā)熱模塊產(chǎn)生空氣循環(huán)加熱，同時(shí)使用多個(gè)方向風(fēng)扇旋轉(zhuǎn)使孵育腔內(nèi)形成流動(dòng)氣體，保證溫度的均勻性。其核心快速功能是采用特有的微處理溫控技術(shù)，加快孵育樣本升溫曲線，使樣本溫度快速穩(wěn)定達(dá)到最佳孵育恒溫點(diǎn)（常規(guī)水浴等方式的升溫曲線較慢，50～60min樣本溫度才能趨近于37℃恒溫點(diǎn)，而快速孵育方式可控制在10min以內(nèi)趨近恒溫點(diǎn)）；同時(shí)孵育全過程中結(jié)合振蕩，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合，能一定程度上增加試劑的靈敏度。從圖1中的曲線4可以看出，酶標(biāo)板在恒溫箱中，微孔液體從常溫狀態(tài)要升到最佳孵育的恒溫線（一般為37℃）處，需要較長的升溫過程。實(shí)驗(yàn)證明，要達(dá)到接近恒溫線的E點(diǎn)，需要50min以上，而從E到F點(diǎn)最佳孵育段，僅需要5min即可。由此可見，整個(gè)孵育過程，絕大部分時(shí)間浪費(fèi)在較長的升溫過程上。而酶標(biāo)板快速孵育器是在短時(shí)間內(nèi)將孵育室溫度升到高于恒溫點(diǎn)4℃以上，拉大孵育室腔體空氣與酶標(biāo)板微孔液體的溫差，當(dāng)曲線（2）酶標(biāo)板溫度離恒溫點(diǎn)還差1～2℃時(shí)，此時(shí)曲線1孵育室腔體溫度也升到最高點(diǎn)B（此點(diǎn)根據(jù)室溫實(shí)際情況自動(dòng)設(shè)置，一般高于恒溫點(diǎn)4～10℃以內(nèi)），然后斷開加熱，鼓風(fēng)機(jī)繼續(xù)排風(fēng)快速降溫。降溫過程溫差仍然很大，酶標(biāo)板繼續(xù)升溫，當(dāng)?shù)竭_(dá)接近恒溫點(diǎn)的C點(diǎn)時(shí)，孵育室溫度也迅速降到恒溫點(diǎn)恒溫，以保證微孔液體在不超過37℃的同時(shí)與孵育室在恒溫點(diǎn)趨于一致的情況下進(jìn)行孵育。

本實(shí)驗(yàn)使用酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行孵育，在達(dá)到相等孵育效果的前提下，可大大節(jié)省孵育時(shí)間。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，在一定的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)的溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，可以使反應(yīng)的時(shí)間縮短［7］，酶標(biāo)板快速孵育器就是采用前期加溫造就一個(gè)孵育室高溫環(huán)境，使酶標(biāo)板與孵育室的溫差增大而快速升溫。當(dāng)酶標(biāo)板的溫度接近最佳孵育的恒溫點(diǎn)時(shí)，此時(shí)孵育室的溫度也迅速降到恒溫點(diǎn)恒溫，大大縮短酶標(biāo)板的升溫時(shí)間，從而達(dá)到快速孵育的目的。

根據(jù)ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室-質(zhì)量和能力的專用要求，乙肝表面抗原為定性檢測，實(shí)驗(yàn)室使用新方法時(shí)需要進(jìn)行驗(yàn)證。本文對(duì)批內(nèi)重復(fù)性（精密度）、臨界值、陰性值、陽性值的符合率進(jìn)行了驗(yàn)證，ELISA試劑盒推薦方法和酶標(biāo)板快速孵育法的重復(fù)性均符合標(biāo)準(zhǔn)。以HBsAg檢測為例進(jìn)行應(yīng)用快速孵育法優(yōu)化酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在孵育時(shí)間縮短到原來的1/2、1/3時(shí)，陰性、陽性低值、陽性中值、陽性高值樣本符合率達(dá)到100%；在孵育時(shí)間縮短到原來的1/4時(shí)，陽性低值即臨界值樣本符合率80.0%，小于95%，故該孵育時(shí)間不可采用。臨床上臨界值樣本結(jié)果的判讀十分重要，誤讀會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，影響醫(yī)生對(duì)病情的治療，故建議使用酶標(biāo)板快速孵育器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，時(shí)間最短縮短為原來的1/3。

通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)時(shí)，快速孵育法可滿足臨床檢測，可以通過縮短孵育時(shí)間提高整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高工作效率。酶標(biāo)板快速孵育法可用于ELISA實(shí)驗(yàn)孵育，但具體孵育時(shí)間需在自己實(shí)驗(yàn)室對(duì)具體實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行摸索、驗(yàn)證。

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Evaluation of Rapid Incubation Optimization Process of Enzyme-linked Immunosorbent Assay on Hepatitis B Surface Antigen Detection

LIU Li，HE Lu，KONG Fan-hong，CAO Jing-li，WANG Ya-jie
（Beijing Tian Tan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

Objective To evaluate the rapid incubation of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）on hepatitis B surface antigen.The goal is to reduce the incubation time in order to improve operational efficiency.Methods Hepatitis B surface antigen positive samples detected by chemiluminescence were used in the study.The samples were divided into 3 groups with 30 cases in each group based on the posititivity value，highly positive，borderline positive，negative samples.All samples were tested with ELISA kit both by standard method recommended by manufacturer and by fast incubation method.The results were comparated and analyzed.Results When incubation time was shortened to one-half and one-third of standard time，the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%.When the time is shortened to one quarter of standard time the results from rapid incubation method and chemiluminescence detection matched 100%in all highly positive samples.For the borderline samples，results from both methods matched 100%.For fast incubation method，there were 6 results which were inconsistent with chemiluminescence，80%.Conclusion The study confirmed that ELISA rapid incubation method satisfied the use of clinical testing；the incubation time may be reduced to one-third or one-half of recommended time.The rapid incubation method will improve the work efficiency in clinical laboratories.

ELISA； Rapid Incubation

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.028

2015-12-24；

2016-01-07

家自然科學(xué)基金（81572474）；首都醫(yī)科大學(xué)校長基金（2015JYY80）；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項(xiàng)目（JJ2015-14）

王雅杰。E-mail：tiantanwyj@aliyun.com