檳榔黃化植原體在葉片中周年消長規(guī)律探究

車海彥 曹學(xué)仁 林雅婷 羅大全

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所 海南海口571101)

檳榔病理性黃化病是一種由植原體引起的病害，在生產(chǎn)上的危害日益嚴重，危害面積逐年擴大，已成為海南檳榔種植業(yè)發(fā)展的限制因素之一。國內(nèi)外研究者在檳榔病理性黃化病病原鑒定、檢測、傳播媒介和防控等方面做了許多工作［1-10］，但尚缺乏檳榔黃化植原體在葉片中的周年消長規(guī)律研究。本研究采取定點定株取樣方式，采用巢式PCR方法，研究季節(jié)變化與檳榔黃化植原體在葉片中消長的關(guān)系，同時分析黃化病田間癥狀隨季節(jié)變化的特點，以期為檳榔黃化病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣時間和地點

2個采樣地點分別位于海南省瓊海市嘉積鎮(zhèn)（110.40°E，19.20°N）和 萬 寧 市 龍 滾 鎮(zhèn)（110.50°E，19.05°N），采樣時間為2019年2月至2020年1月每月的中下旬，樹齡均為10年。

1.1.2 試驗材料

每個檳榔園選取10株感病植株，采集植株下部倒數(shù)第2張羽狀復(fù)葉上的小葉。瓊海市和萬寧市采樣點植株樣品編號分別為QH1～10和WN1～10。健康檳榔葉片采自海南省儋州市寶島新村。

1.2 方法

1.2.1 檳榔葉片總DNA的提取

每片小葉上隨機選取3個部位，混合磨樣。采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取檳榔葉片總DNA，提取方法詳見試劑盒說明，提取的DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檳榔黃化植原體的檢測

檳榔黃化植原體檢測參考車海彥等［11］的方法。以本實驗室保存的含有檳榔黃化植原體的DNA樣品為陽性對照，提取的健康檳榔葉片總DNA為陰性對照，無菌雙蒸水為空白對照。以R16mF2/R16mR1［12］作為第一引物對，R16F2n/R16R2［13］作為第二引物對，進行巢式PCR（nested–PCR）檢測，引物序列見表1。引物合成委托北京六合華大基因科技有限公司。直接PCR以1.2.1中提取的總DNA為模板，將直接PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為巢式PCR的模板。

兩次PCR反應(yīng)體系均為25μL，含2×TaqPCR Mastermix 12.5μL、10 μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL和滅菌ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，50/52℃退火45 s（退火溫度見表1），72℃延伸45 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

表1 引物序列

巢式PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，用Fusion FX7 Spectra多功能成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。特異性片斷長度約為1 200 bp，若存在特異性片斷，檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。

1.2.3 溫度數(shù)據(jù)收集

從全國歷史天氣網(wǎng)站（http：//www.tianq‐ihoubao.com/lishi/）中獲取海南省瓊海市和萬寧市2019年2月至2020年1月的月平均溫度數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔黃化植原體的檢測結(jié)果

檳榔黃化植原體定株檢測結(jié)果（圖1、表2、圖2）顯示，不同月份，植原體檢出率不同。瓊海采樣點植原體周年檢出率為0～100%，萬寧為0～80%。溫度較高的月份植原體檢出率遠高于溫度較低的月份，如在月平均溫度最低的12月份，20株檳榔葉片中植原體的檢出率為0。同時也發(fā)現(xiàn)，有些樣品檢測結(jié)果存在不穩(wěn)定性，如QH8樣品，在4、5、7、10月份均檢測到植原體，但6、8、9月份未檢測到植原體。上述結(jié)果說明，植原體在檳榔葉片內(nèi)的含量周年內(nèi)發(fā)生消長，植原體在葉片內(nèi)的含量變化與溫度有一定的相關(guān)性，檳榔黃化植原體在葉片中可能存在著分布不均勻的現(xiàn)象。

圖1 2019年10月份采集樣品的檳榔黃化植原體檢測結(jié)果電泳圖

2.2 檳榔黃化病田間癥狀隨季節(jié)變化情況

根據(jù)多年的觀察發(fā)現(xiàn)，由植原體引起的黃化病在初期會有明顯的發(fā)病中心，田間有黃化型（圖3-A）和束頂型（圖3-B）2種典型癥狀。黃化型病株在發(fā)病初期，檳榔樹倒數(shù)第2～3片葉緣1/4處開始出現(xiàn)黃化，植株能開花但不能正常結(jié)果，黃化癥狀逐年加重，田間感病植株大多表現(xiàn)此癥狀；束頂型病株的頂部葉片明顯縮小，節(jié)間縮短，田間少部分病株表現(xiàn)此癥狀。感染黃化病的檳榔樹只開花不結(jié)果，或者開花后花穗枯萎不能結(jié)果，或者開花后結(jié)少量品質(zhì)較差的果實。

植原體引起的黃化癥狀與氣候因素關(guān)系密切，會隨季節(jié)變化而發(fā)生改變。11月至次年4月為旱季，降雨量較少，由植原體引起的黃化癥狀加重，但此時易與由干旱等因素導(dǎo)致的黃化癥狀相混淆。每年5～10月是海南島的雨季，由植原體引起的輕癥黃化病株葉片可能會完全轉(zhuǎn)綠，中重癥病株葉片癥狀會有所緩解，但輕癥病株葉片轉(zhuǎn)綠進程會慢于由干旱引起的葉片黃化植株。每年6月份是最容易根據(jù)田間癥狀識別檳榔黃化病的月份；此外，田間癥狀識別還應(yīng)結(jié)合室內(nèi)病原物的分子檢測進行綜合判斷。

表2 兩個采樣地檳榔黃化植原體周年定株檢測結(jié)果

圖2 檳榔黃化植原體檢出率和月平均氣溫關(guān)系圖

圖3 檳榔黃化病田間癥狀

3 討論

植原體在寄主體內(nèi)含量和分布部位可隨季節(jié)發(fā)生一定的變動［14］。前人對幾種林木植原體的病害研究發(fā)現(xiàn)，植原體在冬季到來之前從地上部運轉(zhuǎn)到根部越冬，次年春天又回到地上部進行繁殖和危害，葉片內(nèi)植原體含量隨氣溫升高明顯增加［15-17］。本研究中，檳榔黃化植原體病原在葉片中的檢出率總體隨著溫度升高而增加，隨著溫度的下降而減少，說明檳榔黃化植原體在病株葉片內(nèi)含量周年內(nèi)發(fā)生消長；在一定的溫度范圍內(nèi)，葉片中植原體含量與溫度成正相關(guān)。溫度降低時可能不利于植原體在葉片內(nèi)繁殖，或葉片中的植原體轉(zhuǎn)移到植株的其它部位。今后需通過進一步的實驗來明確檳榔黃化植原體隨季節(jié)變化在植株體內(nèi)的分布規(guī)律。

檳榔是典型的熱帶植物，在旱季（每年11月至次年4月）缺水時，檳榔樹尤其是幼樹的葉片會表現(xiàn)出明顯的黃化現(xiàn)象，此癥狀初期與黃化病引起的葉片黃化極為相似。隨著雨季（每年5～10月）來臨，水分充足，檳榔葉片會完全恢復(fù)綠色。感染黃化病的檳榔樹，在旱季葉片黃化癥狀會加重，雨季來臨后，黃化癥狀會有所緩解，但不能像因干旱引起的黃化那樣完全恢復(fù)正常，由此可見，檳榔葉片黃化程度與水分條件存在明顯的相關(guān)性。若檳榔園內(nèi)植株發(fā)生黃化現(xiàn)象，但又未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)病中心，一定要結(jié)合室內(nèi)分子檢測來判斷黃化現(xiàn)象是否為由植原體引起的病理性黃化。