超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米中莠去津及其代謝物的殘留量和風險評估

楊志富，歐曉明，梁 驥，梁貴平，劉義珂，于琴琴

(1.湖南化工研究院有限公司 國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410014；2.農(nóng)用化學品湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410014；3.湖南加法檢測有限公司，湖南 長沙 410014)

莠去津(Atrazine，ATZ)，化學名稱為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-二嗪，是一種人工合成的選擇性內(nèi)吸傳導型三嗪類除草劑，主要用于防除旱地一年生禾本科雜草和闊葉雜草，因其對玉米有較好的選擇性，廣泛用于玉米地雜草的防治[1]。ATZ雖是低毒型除草劑，但由于其溶解性好、殘效期長，隨著施用量的增大，會造成環(huán)境污染[2]。同時，ATZ作為內(nèi)分泌干擾物，會影響生物體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)，對人類的生殖和發(fā)育也會產(chǎn)生不利影響[3-5]。

莠去津施用后，在化學、光照及微生物等作用條件下可被降解，其主要的降解產(chǎn)物有脫乙基莠去津(Deethyl-atrazine，DEA)、脫異丙基莠去津(Deisopropyl-atrazine，DIA)、脫乙基脫異丙基莠去津(Deethyl-deisopropyl-atrazine，DDA)、2-羥基莠去津(Hydroxyatrazine，HYA)[1]，DEA、DIA、DDA、HYA與ATZ具有相同的毒性模式，對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴重威脅[6]。

目前，莠去津的殘留檢測方法主要有氣相色譜[7-8]、液相色譜[9-10]以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13-14]等，涉及到的樣品基質(zhì)主要為水[15-16]、土壤[17]、米[18]、玉米[19-20]、茶葉[21]等，檢測莠去津母體的居多，鮮有玉米基質(zhì)中同時對莠去津及其代謝物的檢測方法、殘留特性及安全性的報道。受農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)委托，本文以30%苯唑草酮·莠去津·辛酰溴苯腈可分散油懸浮劑在玉米上的殘留登記試驗項目為背景，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定玉米基質(zhì)中莠去津及其代謝物DEA、DIA、DDA、HYA的殘留分析檢測方法，并對其在玉米中的長期膳食攝入進行了風險評估，以期為玉米中莠去津及其代謝物殘留量的檢測和安全合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 ATZ標準品(98.1%)，DEA、DIA、DDA、HYA標準品(99.0%，98.9%，97.8%，96.8%)，甲醇(質(zhì)譜純)，甲酸(質(zhì)譜純)，乙腈(色譜純)，二氯甲烷、氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純)，水(超純水)。

1.1.2 儀器 Agilent1290/G6470三重四級桿液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀(配有Agilent EC-C18，2.1×100mm×2.7μm色譜柱)；SPS 402F型電子天平(0.01g)；AL204型電子天平(0.000 1g)；Hei-vap型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 田間試驗 按照NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[22]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[23]并結(jié)合《農(nóng)藥登記殘留試驗區(qū)域指南》[24]要求設(shè)計，于2020年分別在遼寧沈陽、內(nèi)蒙古呼和浩特、陜西西安、北京順義、河北石家莊、山東青島、河南鄭州、江蘇南京、湖南瀏陽、廣西玉林、貴州貴陽、廣東佛山進行，供試作物為玉米，被試物為30%苯唑草酮·莠去津·辛酰溴苯腈可分散油懸浮劑。

1.2.1 最終殘留試驗 按農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則要求設(shè)計2個試驗小區(qū)：1個處理小區(qū)和1個對照小區(qū)，每個小區(qū)面積100m2。對照小區(qū)設(shè)置在水流和風向的上部，并和處理小區(qū)之間設(shè)緩沖帶以避免交叉污染，施清水對照，采集對照樣品。施藥時期為玉米3～6葉期，以450g a.i/ha(制劑100g/667m2)的劑量噴霧施藥1次，于鮮食玉米收獲期采集鮮食玉米和秸稈、成熟玉米收獲期采集成熟玉米籽粒和秸稈。

1.2.2 樣品采集、制備與儲存 鮮食玉米(包含玉米軸和籽粒)樣品：在小區(qū)中用隨機方式采集2個平行樣品，從>12株玉米上至少采集12個玉米穗，去除苞葉及花絲，取≥2kg樣品裝入樣本容器中包扎妥當，8h內(nèi)運回實驗室。將鮮食玉米沿縱向均勻地切成四瓣，取不相鄰的兩瓣，切碎，加干冰粉碎樣品，待干冰揮發(fā)后，取150g樣品2份分別裝入封口樣品容器中，容器內(nèi)外貼好標簽，-18℃以下冰箱中保存。

成熟玉米籽粒樣品(簡稱玉米樣品)：在小區(qū)中用隨機方式采集2個平行樣品，從>12株玉米上采集≥12個玉米穗，去除苞葉及花絲，取≥1kg樣品裝入樣本容器中包扎妥當，8h內(nèi)運回實驗室。將玉米田間樣本脫粒，籽?；靹?，加干冰粉碎，待干冰揮發(fā)后，取150g樣品2份分別裝入封口樣品容器中，容器內(nèi)外貼好標簽，-18℃以下冰箱中保存。

秸稈樣品：與鮮食玉米和成熟玉米同時采集，在小區(qū)中用隨機方式采集2個平行樣品，采樣點數(shù)≥12株，取樣部位為地上部分玉米整株秸稈，每株分成上、中、下3個等長的小段(帶葉)，均勻取樣，≥2kg，裝入容器中，8h內(nèi)運回實驗室。將秸稈田間樣本切碎至1cm以下小段，在不銹鋼盆中混勻，加干冰粉碎，待干冰揮發(fā)后，取150g樣品2份分別裝入封口樣品容器中，容器內(nèi)外貼好標簽，-18℃以下冰箱中保存。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 分別稱取已制備的鮮食玉米、玉米、秸稈樣品10g (精確至0.01g)于250mL塑料離心瓶中，加入50mL乙腈-甲酸溶液(9：1，V/V)溶液，超聲提取10min，3 500r/min離心5min，移取10mL上清液至分液漏斗中，加入30mL二氯甲烷、20mL 5%氯化鈉水溶液萃取，二氯甲烷層經(jīng)無水硫酸鈉過濾于100mL圓底燒瓶中，水層再用30mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷層，于45℃水浴減壓濃縮至干，用2mL甲醇-0.1%甲酸/水溶液(1：1，V/V)定容，經(jīng)0.22μm有機相濾膜過濾，待UPLC-MS/MS檢測。

1.3.2 儀器條件 柱溫：35℃；進樣量：10μL；流動相A為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇；流速：0.3mL/min。梯度洗脫條件：0～0.01min，20%B；0～7.00min，20%～60%B；7.00～7.01min，60%～95%B；7.01～9.00min，95%B；9.00～9.01min，95%～20%B；9.01～10.00min，20%B。

離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；離子噴霧電壓：4 500V

霧化氣壓力：40psi；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：9.0L/min；離子監(jiān)測參數(shù)(表1)。

表1 莠去津及其化合物的UPLC-MS/MS參數(shù)

續(xù)表

1.3.3 標準工作曲線 單個標準儲備液：準確稱取ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的標準品各0.025g(精確至0.000 1g)，以甲醇溶解并定容至50mL，分別配制成質(zhì)量濃度為500mg/L的單個標準儲備液，于-20℃避光密封儲存，備用。

混合標準溶液的配制：分別準確量取一定體積的單個標準儲備液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10mg/L的ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的混合標準溶液，于-20℃保存，備用。定量測定時，用甲醇和鮮食玉米、成熟玉米、秸稈空白基質(zhì)提取液配制溶劑和基質(zhì)系列混合標準溶液，待基質(zhì)效應考察結(jié)果確定定量標準工作曲線。

1.3.4 添加回收試驗 分別在鮮食玉米、玉米或秸稈空白樣本中添加3個不同質(zhì)量分數(shù)ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的添加水平0.01mg/kg、0.05mg/kg、1.0mg/kg，每個添加水平5次重復，分別計算添加回收率平均值和相對標準偏差(RSD%)(表3)。

1.4 風險評估 長期膳食攝入風險評估根據(jù)規(guī)范殘留試驗中值(STMR)計算其國家估算每日攝入量(NEDI)，按公式(1、2)進行計算[25-27]：

NEDI=∑[STMRi×Ei×Pi×Fi]/bw

(1)

RQ(%)=NEDI/ADI

(2)

式(1)中：NEDI為國家估算每日攝入量[μg/(kg·d)]；STMRi為第i類農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范試驗殘留中值(mg/kg)；Ei和Pi分別為食品的可食部分因子和食品加工因子，本試驗中均為1；Fi為不同人群對i類農(nóng)產(chǎn)品的膳食消費量(g)；bw為我國人均體重(kg)，按63kg[28]計算。式(2)中：ADI為每千克體重的農(nóng)藥日允許攝入量(mg/kg)；RQ為風險商，RQ≤1時，表示因膳食攝入所產(chǎn)生的農(nóng)藥對特定人群的健康影響處于可接受水平，RQ越小，風險越低。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準工作曲線的確定 玉米相關(guān)基質(zhì)中含有一些雜質(zhì)，可能對農(nóng)藥目標物產(chǎn)生基質(zhì)效應，對檢測結(jié)果造成影響。為驗證基質(zhì)效應，用甲醇和鮮食玉米、玉米、秸稈空白基質(zhì)提取液分別配制0.005、0.01、0.05、0.1、0.5μg/mL的系列標準工作液進行比較，并按上文所述儀器條件平行測定3次，以目標物峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x，μg/mL)繪制標準曲線，計算基質(zhì)標液與溶劑標液的斜率比(表2)。

表2 5種目標物的溶劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線

續(xù)表

基質(zhì)效應(ME)=基質(zhì)標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率，當ME>1.1時，表示基質(zhì)增強效應；ME<0.9時，表示基質(zhì)效應減弱；0.9

2.2 儀器條件的確定 配制0.1μg/mL的ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA單一標準溶液，全掃確定母離子后，采用自動調(diào)諧對各目標化合物進行質(zhì)譜條件優(yōu)化，從而得到最優(yōu)質(zhì)譜測定條件。通過降低流速和調(diào)整流動相初始比例(前處理后得到的待測樣品中各溶劑比例與流動相中各溶劑比例相適應)，可使5種目標物獲得較好的保留和峰形。適量加入甲酸可以提高5種目標物的離子化效率，進而提高響應，在上述儀器條件下，ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的分離效果及總離子流色譜圖(圖2)。

圖2 ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的分離效果及總離子流色譜圖(溶劑標0.05μg/mL)

2.3 回收率和精確度 按1.3的分析方法，在鮮食玉米空白樣品中，添加水平濃度ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的平均回收率分別為95%～102%、90%～97%、86%～106%、90%～107%、88%～102%，相對標準偏差分別為2%～5%、4%～6%、3%～7%、2%～7%、3%～5%；在玉米空白樣品中，ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的平均回收率分別為95%～103%、93%～97%、101%～107%、88%～107%、90%～105%，相對標準偏差分別為2%～4%、3%～4%、2%～10%、2%～6%、3%～8%；在秸稈空白樣品中，ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的平均回收率分別為94%～104%、94%～100%、99%～106%、99%～106%、91%～103%，相對標準偏差分別為1%～4%、3%～6%、4%～8%、2%～5%、3%～7%。以上結(jié)果均滿足NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求，說明該檢測方法可行(表3)，玉米基質(zhì)中ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA空白和添加回收色譜圖(圖3～4)。

表3 ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA在鮮食玉米、玉米、秸稈中的添加回收率(n=5)

圖3 玉米基質(zhì)中ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA空白色譜圖

圖4 玉米基質(zhì)中ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA添加回收(0.01mg/kg)色譜圖

2.4 最終殘留 30%苯唑草酮·莠去津·辛酰溴苯腈可分散油懸浮劑以450g a.i/ha(制劑100g/667m2)的劑量于玉米3～6葉期莖葉噴霧施藥1次，于鮮食玉米收獲期采集鮮食玉米和秸稈、成熟玉米收獲期采集成熟玉米籽粒和秸稈。莠去津的殘留物監(jiān)測定義為莠去津，膳食風險評估定義為莠去津、脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、脫乙基脫異丙基莠去津與2-羥基莠去津之和，以莠去津表示。莠去津(殘留物監(jiān)測定義)在鮮食玉米、玉米、秸稈中的殘留量均<0.01mg/kg，莠去津(膳食風險評估定義)在鮮食玉米、玉米、秸稈中的殘留量均<0.05mg/kg。

檢測結(jié)果為莠去津及其代謝物的殘留量均低于檢測限，也低于GB/T 2763-2019[29]中制定的莠去津在玉米上的MRL值(0.05mg/kg)，沒有造成積累。表明按推薦GAP信息，莠去津在玉米地除草使用后，不同收獲時期采集的玉米是相對安全的。

2.5 風險評估結(jié)果 通過中國農(nóng)藥信息網(wǎng)[30]查詢到莠去津在我國已登記使用的農(nóng)作物有玉米、高粱、糜子、大蒜、大蔥、姜、蘋果、梨、葡萄、甘蔗、茶葉等。本次試驗結(jié)果為：鮮食玉米和玉米中莠去津殘留中值均<0.01mg/kg。GB 2763-2019中莠去津的ADI值為0.02mg/kg。綜合以上數(shù)據(jù)，以我國不同人群的膳食結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，根據(jù)公式(1、2)計算國家估算每日攝入量和風險商值，判斷其攝入水平。代入莠去津在不同農(nóng)產(chǎn)品中的MRL值和本次規(guī)范殘留試驗的殘留中值(STMR)，計算出在不同農(nóng)產(chǎn)品中的NEDI值為0.084μg/(kg·d)，RQ值為0.4%。風險評估結(jié)果表明莠去津膳食風險很低，通常不會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風險。

3 結(jié)論

本文建立了鮮食玉米、玉米、秸稈中莠去津及其代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法操作簡單，回收率和精密度均較高，可同時檢測玉米相關(guān)基質(zhì)中ATZ、DEA、DIA、DDA、HYA的殘留量，滿足玉米中莠去津的監(jiān)測和登記試驗需求。據(jù)1年12地玉米中莠去津的農(nóng)藥規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)，對莠去津在玉米上使用后進行風險評估，收獲的鮮食玉米和成熟玉米其風險評估結(jié)果均遠<100%，表明莠去津按推薦GAP使用后，殘留量的風險在可控范圍內(nèi)，對一般人群的健康不會產(chǎn)生危險。