指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地消瘤藤質(zhì)量

黃建猷 ，胡筱希，麥琬婷，黃周鋒 ，章 波，陸國壽 *，葉 勇*

1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022

2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022

3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021

消瘤藤是虎耳草科冠蓋藤屬植物星毛冠蓋藤Pileostegia tomentellaHand.-Mazz的藤莖，主要分布于浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西、貴州等地[1]。廣西民間瑤醫(yī)多年的臨床實(shí)踐證明，消瘤藤具有抗腫瘤作用，可用于治療多種惡性腫瘤；同時(shí)也是廣西金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院腫瘤科用于治療各種腫瘤的主藥[2-3]，消瘤藤主要含有香豆素類、環(huán)烯醚萜苷類和苯丙素類等化學(xué)成分[3-6]，具有祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、消腫解毒的功效，現(xiàn)代藥理研究顯示，其不同提取部位及總香豆素等具有抗腫瘤作用[7-10]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道消瘤藤藥材質(zhì)量研究，但依然存在質(zhì)量控制指標(biāo)簡(jiǎn)單等問題，無法系統(tǒng)地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地消瘤藤藥材質(zhì)量的差異性[11-12]。鑒于此，本研究首先建立了消瘤藤藥材的HPLC指紋圖譜，并以多波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定其中茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當(dāng)藥苷的含量，通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和Origin Pro軟件對(duì)其進(jìn)行主成分分析及聚類分析，對(duì)不同產(chǎn)地消瘤藤藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3色譜工作站，美國Waters公司）；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KS-3200DE液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

7-羥基-8-甲氧基香豆素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)X14O10L100104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）；茵芋苷（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq19011409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；7-羥基香豆素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)A04A6L1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；當(dāng)藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111742-200501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；紫丁香苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111574-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）。磷酸（廣東光華科技股份有限公司，分析純），乙醇（廣東光華科技股份有限公司，分析純），乙腈（默克股份兩合公司，色譜純），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Milipore公司）。

1.3 藥材

消瘤藤分別采集于廣西不同地點(diǎn)，具體見表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為冠蓋藤屬植物星毛冠蓋藤P.tomentellaHand.- Mazz.的藤莖。

表1 消瘤藤藥材信息Table 1 Information table of 14 batches of Pileostegia tomentella Hand.

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取消瘤藤粉末（過40目篩）約0.5 g，精密稱定。置具塞三角瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，放至室溫，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量、搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當(dāng)藥苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當(dāng)藥苷質(zhì)量濃度分別為234.80、68.48、3.27、24.31、38.17 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～45 min，95%～60% A；45～46 min，60%～95% A；46～60 min，95% A；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以6號(hào)峰（茵芋苷）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于2%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄色譜圖，以6號(hào)峰（茵芋苷）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，一式6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以6號(hào)峰（茵芋苷）為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的標(biāo)定 取14批不同產(chǎn)地消瘤藤粉末，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，獲取14批消瘤藤指紋圖譜。將14批不同樣品的色譜圖導(dǎo)入由國家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，以S1為參照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，選擇消瘤藤中的主要成分且分離較好的色譜峰作為共有峰。

經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”得到14批消瘤藤指紋圖譜（圖1）和對(duì)照指紋圖譜（圖2），且共標(biāo)定了12個(gè)共有峰，12個(gè)共有峰總面積占總峰面積的90%以上，因此確定12個(gè)色譜峰為消瘤藤指紋圖譜的共有峰。

圖1 14批消瘤藤HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches of Pileostegia tomentella

圖2 消瘤藤對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Comparison fingerprint of Pileostegia tomentella

2.5.2 相似度 將得到的14批消瘤藤指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”，進(jìn)行色譜峰匹配，生成消瘤藤對(duì)照指紋圖譜，并計(jì)算不同批次之間的相似度。14批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度分別為0.944、0.937、0.965、0.899、0.959、0.965、0.965、0.942、0.967、0.901、0.875、0.975、0.905、0.955。除全州龍水鎮(zhèn)、藤縣2個(gè)產(chǎn)地的藥材外，其余產(chǎn)地的消瘤藤藥材相似度均大于0.9，說明這些產(chǎn)地消瘤藤藥材質(zhì)量差異較?。欢菘h龍水鎮(zhèn)和廣西藤縣的消瘤藤藥材相似度均接近0.9，說明這2個(gè)產(chǎn)地的消瘤藤雖然具有一定相似性，但質(zhì)量差異較大。

2.5.3 主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn) 采用對(duì)照品對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄HPLC色譜圖，通過比較各峰保留時(shí)間和紫外吸收光譜，對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)。消瘤藤樣品HPLC指紋圖譜中茵芋苷（6號(hào)峰）、紫丁香苷（7號(hào)峰）、當(dāng)藥苷（10號(hào)峰）、7-羥基香豆素（11號(hào)峰）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（12號(hào)峰）得到了化學(xué)指認(rèn)。

2.6 HPLC同時(shí)測(cè)定消瘤藤中5種有效成分的含量

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～50 min，95%～70% A；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246、265、320 nm；進(jìn)樣體積10 μL。茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當(dāng)藥苷5個(gè)成分按此色譜條件進(jìn)行分析，理論塔板數(shù)均不低于3000，分離度均大于1.5，各成分測(cè)定不受它成分干擾。對(duì)照品和供試品的色譜圖見圖3。

圖3 混合對(duì)照品溶液 (A) 和消瘤藤供試品溶液 (B) HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution (A) and pileostegia tomentella test solution (B)

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，即得回歸方程及線性范圍。回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)分別為：茵芋苷Y=2 019 280.3X－8 147.4，線性范圍0.234 8～2.348 0 μg，r=0.999 8；紫丁香苷Y=2 928 157.5X－491.2，線性范圍0.00 327～0.03 27 μg，r=0.999 6；當(dāng)藥苷Y=2 189 650.3X－6 371.9，線性范圍0.038 17～0.381 7 μg，r=0.999 7；7-羥基香豆素Y=4 140 844.6X－6 992.5，線性范圍0.068 48～0.684 8 μg，r=0.999 8；7-羥基-8-甲氧基香豆素Y=4 979 120.6X－2 767.7，線性范圍0.024 31～0.243 1 μg，r=0.999 9；結(jié)果表明5種成分在上述質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液在“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為0.48%、0.83%、0.68%、0.29%和0.52%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取消瘤藤藥材（S1）粉末1份，約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h后按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為0.80%、1.35%、1.03%、0.87%和0.96%，表明供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批消瘤藤藥材（S1）粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.48%、2.01%、1.97%、1.88%和1.39%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批消瘤藤藥材（S1）粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，加入混合對(duì)照品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算回收率。茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的平均加樣回收率分別為99.85%、97.62%、98.98%、98.87%和99.01%，RSD值分別為1.77%、2.63%、2.57%、2.55%和2.38%。

2.6.7 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地消瘤藤藥材粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品中茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個(gè)成分的量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n＝2)Table 2 Results of contents determination of samples (n＝2)

2.7 化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1 聚類分析 采用Origin Pro軟件通過平均聚類方法對(duì)14批藥材樣品采用分層聚類分析。這14批藥材可以分為3類，第1類為S1、S2；第2類為S7、S10、S12、S14；第3類為S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。聚類圖見圖4。

圖4 聚類熱圖Fig.4 Cluster analysis tree diagram

2.7.2 主成分分析 為了進(jìn)一步比較不同產(chǎn)地批次間消瘤藤樣品的質(zhì)量差異，將消瘤藤中的茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個(gè)成分的含量作為變量導(dǎo)入到SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行主成分分析。選取其中特征值大于1的前2個(gè)因子作為主成分1（PC1）與主成分2（PC2），貢獻(xiàn)率分別為62.692%和21.441%，對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)84.136%（表3），故PC1和PC2 2個(gè)主成分可反映消瘤藤藥材的整體綜合質(zhì)量。

表3 特征值和累積貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and cumulative contribution

由表4因子載荷矩陣可知，PC1與茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個(gè)成分均呈正相關(guān)；PC2與紫丁香苷和7-羥基-8-甲氧基香豆素呈正相關(guān)。根據(jù)公式F＝Zx×t計(jì)算各主成分值，其中Zx原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化得標(biāo)準(zhǔn)化矩陣，t為標(biāo)準(zhǔn)化的正交特征向量矩陣。根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率，計(jì)算出綜合得分，其公式為F＝0.626 95×F1＋0.214 41×F2，分別以PC1與PC2建立坐標(biāo)系，得到主成分分析散點(diǎn)平圖（圖5），各主成分值及綜合排序結(jié)果見表5。

表4 因子載荷矩陣Table 4 Load matrix of factors

表5 主成分值及綜合主成分值Table 5 Principal component values and comprehensive principal component values

由圖5可看出，PC1和PC2可將樣品分為3類，第1類為S1、S2；第2類為S7、S10、S12、S14；第3類為S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。主成分分析與聚類分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了PC1和PC2可代表消瘤藤的質(zhì)量用于產(chǎn)地劃分。主成分分析得到的綜合主成分值，根據(jù)得分情況反映各產(chǎn)地消瘤藤的質(zhì)量情況，質(zhì)量越好，綜合得分越高。本研究中S12、S1、S14質(zhì)量相對(duì)較優(yōu)。

圖5 主成分分析散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plots of principal component analysis

4 討論

消瘤藤是傳統(tǒng)瑤醫(yī)藥治療癌癥的主要藥材之一，已被列入《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》擬收錄品種。由于地區(qū)的差異，可能導(dǎo)致消瘤藤品質(zhì)上的不同，進(jìn)而可能影響其藥效。本研究通過對(duì)廣西不同產(chǎn)地的14批消瘤藤藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14批次間樣品相似度較好，質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。后續(xù)又測(cè)定了茵芋苷、紫丁香苷、當(dāng)藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5種有效成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地間含量存在較大差異。通過聚類分析和主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別法[13-14]對(duì)其進(jìn)行全面綜合的質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果表明S1、S12、S14等產(chǎn)地的消瘤藤質(zhì)量較好。

文獻(xiàn)報(bào)道[15]，香豆素類化合物具有抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎鎮(zhèn)痛及抗菌等多種藥理活性，具有潛在的藥用價(jià)值，其中抗腫瘤作用是一個(gè)研究熱點(diǎn)；環(huán)烯醚萜類化合物在抗腫瘤、抗炎、降血糖、保肝活性等方面受到學(xué)者廣泛關(guān)注[16]；紫丁香苷具有具有一定的體內(nèi)外抗腫瘤活性[17]。結(jié)合主成分分析綜合得分及5個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果可知，綜合得分排在前3的S1、S12、S14其5個(gè)成分的含量也非?？壳?，綜合得分排在倒數(shù)前3的S9、S6、S5其5個(gè)成分的含量也非常靠后。綜合得分與5個(gè)成分的含量是怎樣一個(gè)關(guān)系，還有待進(jìn)一步的研究。

中藥質(zhì)量控制研究一直是中藥研究與發(fā)展的關(guān)鍵[18]，在中藥現(xiàn)代化的研究進(jìn)程中，指紋圖譜技術(shù)是當(dāng)今國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控模式。本研究建立指紋圖譜與含量測(cè)定相結(jié)合，應(yīng)用化學(xué)模式識(shí)別法可全面評(píng)價(jià)消瘤藤質(zhì)量。該法的建立為消瘤藤的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突