天麻中糖基轉(zhuǎn)移酶基因GeGT1的克隆及原核表達(dá)分析

劉夢(mèng)麗，余函紋，單婷玉，吳君賢，彭華勝, ，程銘恩，查良平*，桂雙英,

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230038

2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012

4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012

5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012

天麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，原名“赤箭”，因其莖似箭，端有花，遠(yuǎn)看如箭有羽而得名[1]。天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，性甘、平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)和祛風(fēng)通絡(luò)的功效[2]。天麻作為藥食同源滋補(bǔ)保健類藥材，包含酚類、有機(jī)酸類、多糖類等多種活性成分[3-4]，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善記憶及延緩衰老等藥理作用[5]。

糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GTs）是一類高度分化的多基因家族酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，GTs能催化糖基團(tuán)從供體分子轉(zhuǎn)移到特異性受體分子，形成各種糖苷化合物[6-8]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分，糖基化反應(yīng)是由GTs介導(dǎo)的植物體內(nèi)的一種重要的次生代謝反應(yīng)，通過(guò)糖基化修飾，能改善天然藥物的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度等[9]。

近年來(lái)，已經(jīng)從霍山石斛[10]、布渣葉[11]、穿心蓮[12]、地黃[13]、長(zhǎng)春花[14]、花楸[15]等藥用植物中克隆出了GTs基因。本研究以天麻作為實(shí)驗(yàn)材料，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)克隆天麻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（glycosyltransferase，GeGT1）的cDNA全長(zhǎng)序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，研究GeGT1不同器官表達(dá)模式，為后期研究GeGT1及其生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試天麻材料來(lái)源于安徽省六安市金寨縣金山寨食（藥）用菌種植專業(yè)合作社，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為蘭科植物Gastrodia elataBl.。天麻進(jìn)入花期后，收集天麻的塊莖、莖和花，迅速放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix Ex Taq?購(gòu)自于TaKaRa公司；高保真酶購(gòu)自于NEB公司；切膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、感受態(tài)細(xì)胞Transetta（DE3）購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 基因數(shù)據(jù)獲取

GeGT1基因序列來(lái)源于天麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（本實(shí)驗(yàn)室），經(jīng)冗余序列去除、序列組裝，功能注釋后分類。其他物種的氨基酸序列均來(lái)自于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 總RNA的提取和cDNA的合成

按照RNA prep Pure Plant Kit試劑盒操作說(shuō)明提取天麻塊莖總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。ND2000（Denovix DS-11＋，S-03512）測(cè)定天麻總RNA的A260和A280值，選擇A260/A280為1.8～2.0的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以RNA為模板，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到天麻的cDNA，合成產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中。

2.3 GeGT1基因的克隆

根據(jù)天麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物。上游引物：GT1-F：5’-ATGGTAGCAGCGGCACAGAATCCAT-3’；下游引 物：GT1-R：5’-TTACAAAAAAAAGGTCCCC TTCCAT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以天麻的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用Phusion High-Fidelity酶（NEB，M0501S），PCR體系為98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，需40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收，然后使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit切膠回收試劑盒回收目的條帶，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至克隆載體pUC-GW-Amp，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑菌并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，挑選8個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送至蘇州金唯智公司完成測(cè)序。

2.4 GeGT1基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線工具BLAST對(duì)基因核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析；ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）；ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)GeGT1基因編碼的蛋白理化性質(zhì)；NPS（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/），進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)合PyMOL軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；SinalP4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行蛋白序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。運(yùn)用ClustalW軟件與其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，用 MEGA 6.06軟件構(gòu)建鄰接（neighbor-joining）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次。

2.5 GeGT1基因的原核表達(dá)

對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)含有接頭序列的無(wú)縫拼接引物，上游引物：GeGT1-BamH I-F：5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGTAGCAG CGGCACAGAATCCAT-3’；下游引物：GeGT1-BamH I-R：5’-CGACGGAGCTCGAATTCGGATTACAAAAAAAAGGTCCCCTTCCAT-3’。以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行切膠回收。用BamH I限制性內(nèi)切酶將pET-28a進(jìn)行單酶切，并進(jìn)行切膠回收。目的基因片段與原核表達(dá)載體進(jìn)行無(wú)縫拼接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂在卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，菌液PCR驗(yàn)證并將8個(gè)陽(yáng)性菌液送至公司測(cè)序。將測(cè)序陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，至A600值為0.6～0.8，加0.4 mmol/L IPTG于28 ℃誘導(dǎo)12 h，收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

2.6 GeGT1基因的表達(dá)水平分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法檢測(cè)GeGT1基因在天麻塊莖、莖、花的相對(duì)表達(dá)量。以天麻β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物。GeGT1基因qRT-PCR上游引物：GT1-RT-F：5’-TGTTGGCGTTAGATGTTTGGA-3’；下游引物：GT1-RT-R：5’-ACCACCCAAACAAACGGA-3’，β-actin基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 上游引物：β-actin-1-F：5’-GGGGATGAAGCACAGTCCAA-3’；下游引物：β-actin-1-R：5’-GCCGTGGTTGTGAAGGAGTA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照“2.2”項(xiàng)方法，提取天麻塊莖、莖和花中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成c DNA，稀釋10倍備用。應(yīng)用Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（安捷倫，美國(guó)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，包括TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL、ROX Reference Dye（50×）0.25 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.25 μL、GT1-RT-F 1 μL、GT1-RT-R 1 μL、c DNA 2 μL、ddH2O 8 μL。PCR條件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中重復(fù)3次，繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 GeGT1基因克隆和序列分析

以天麻的cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條帶約為1503 bp（圖1-A），與目的基因片段大小吻合。重組質(zhì)粒pUC-GWAmp-GeGT1經(jīng)MluI和AscI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得目的基因條帶，約為1503 bp（圖1-B），利用DNAMAN軟件結(jié)合ORF Finder在線軟件對(duì)GeGT1基因cDNA序列進(jìn)行分析，GeGT1基因開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1 503 bp，編碼500個(gè)氨基酸。通過(guò)Genebank中BLASTX功能，對(duì)GeGT1蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果顯示，GeGT1基因與鐵皮石斛Dendrobium catenatumKimura et Migo同源相似性為58.56%，與小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris(Schauer)Rchb.同源相似性為55.48%，與深圳擬蘭Apostasia shenzhenicaZ.J.Liu & L.J.Chen同源相似性為55.14%。比對(duì)結(jié)果表明所獲基因?qū)儆贕Ts家族，將該基因命名為GeGT1，GenBank 注冊(cè)號(hào)為MW015078。

圖1 GeGT1 (A) 和pUC-GW-Amp-GeGT1 (B) 的基因克隆Fig.1 Cloning of GeGT1 (A) and pUC-GW-Amp-GeGT1 (B)

3.2 GeGT1蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線工具ExPASy對(duì)GeGT1基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，GeGT1編碼蛋白由500個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白理論等電點(diǎn)為5.51，相對(duì)分子質(zhì)量為55 494.33，不穩(wěn)定系數(shù)為40.12，脂肪指數(shù)為80.34，可初步判斷GeGT1蛋白為穩(wěn)定的酸性蛋白。

3.3 GeGT1蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用NPS在線軟件對(duì)GeGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示（圖2-A），GeGT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件中無(wú)規(guī)卷曲（random coil）所占的比例最高，包含245個(gè)氨基酸，占49%；α-螺旋包含141個(gè)氨基酸，占28.2%；延伸鏈包含114個(gè)氨基酸，占22.8%。

利用SWISS-MODEL Workspace在線軟件對(duì)GeGT1蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)合PyMOL軟件預(yù)測(cè)得到GeGT1三維空間模型（圖2-B）及GeGT1活性中心氨基酸序列（圖2-C），通過(guò)ExPAsy structure assessment程序評(píng)測(cè)推導(dǎo)，GeGT1蛋白模型6lzx.1.B序列相似性42%，全球性模型質(zhì)量估測(cè)（global model quality estimation，GMQE）值為0.68。

圖2 GeGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary and tertiary structure of GeGT1

3.4 GeGT1蛋白結(jié)構(gòu)功能域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及信號(hào)肽分析

利用NCBI的Conserved domains在線工具對(duì)GeGT1蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（圖3-A），GeGT1的17～418 aa具有UDP-GTs的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明GeGT1蛋白屬于GTB型超家族。利用TMHMM2.0在線工具對(duì)GeGT1進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測(cè)（圖3-B），結(jié)果表明，GeGT1蛋白含有一個(gè)顯著的跨膜螺旋區(qū)，460～482 aa位于跨膜結(jié)構(gòu)域，1～459 aa位于膜外側(cè)，483～500 aa位于膜內(nèi)側(cè)，說(shuō)明GeGT1屬于跨膜蛋白。利用SinalP4.0 Server預(yù)測(cè)分析GeGT1蛋白的信號(hào)肽（圖3-C），結(jié)果顯示存在信號(hào)肽的概率為0.17%，故推測(cè)GeGT1蛋白不存在信號(hào)肽，是非分泌蛋白。

圖3 GeGT1的結(jié)構(gòu)功能域與跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Structural functional domains and transmembrane domains of GeGT1

3.5 GeGT1的氨基酸序列同源比對(duì)

利用DNAMAN軟件對(duì)GeGT1氨基酸序列與其他植物基因進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)。將GeGT1序列與鐵皮石斛糖基轉(zhuǎn)移酶（DcSGT，XP_020677364.1）、深圳擬蘭糖基轉(zhuǎn)移酶（AsUGT，PKA65321.1）、番紅花糖基轉(zhuǎn)移酶（CsUGT，AIF79773.1）進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖4），結(jié)果顯示，這4種植物的同源性為60.25%，其中GeGT1與DcSGT的同源性最高，為58.56%。

圖4 天麻、鐵皮石斛、深圳擬蘭和番紅花GTs氨基酸序列同源性比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence homology alignment of Gastrodia elata Bl, Dendrobium catenatum, Apostasia shenzhenica and Crocus sativus L.glycosyltransferase

3.6 GeGT1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

選取GenBank中記載的25種植物的GTs基因的氨基酸序列：用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建GTs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。結(jié)果顯示，來(lái)源于不同物種GTs基因的蛋白被聚成雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、藻類和菌類，其中GeGT1與鐵皮石斛、深圳擬蘭和小蘭嶼蝴蝶蘭GTs序列位于同一分支點(diǎn)，表明親緣關(guān)系高，進(jìn)一步證實(shí)了蘭科植物GTs基因的同源性。

圖5 GeGT1與其他物種GTs氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of GeGT1 and other species glycosyltransferase amino acid sequences

3.7 GeGT1基因的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-28a-GeGT1轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌株。以pET-28a轉(zhuǎn)入Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照，在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃誘導(dǎo)12 h條件下觀察重組融合蛋白的表達(dá)。同時(shí)重組菌株表達(dá)后收集菌體并進(jìn)行破碎裂解，上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖6），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-GeGT1菌株和上清液在63 000處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶。

圖6 GeGT1蛋白原核表達(dá)分析Fig.6 Prokaryotic expression of GeGT1 protein

3.8 天麻不同器官的GeGT1基因表達(dá)差異分析

運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)了天麻塊莖、莖、花的GeGT1基因表達(dá)差異（圖7）。結(jié)果顯示，GeGT1基因在天麻各個(gè)器官中均有表達(dá)，GeGT1基因在花中的表達(dá)水平最高，其次是塊莖，在莖中的表達(dá)水平最低。

圖7 天麻不同部位的GeGT1基因表達(dá)水平Fig.7 Gene expression levels of GeGT1 in different organ

4 討論

天麻是我國(guó)名貴的中藥材，以塊莖入藥，含有酚酸類、有機(jī)酸類、脂類、多糖類等多種成分，被譽(yù)為“治風(fēng)之神藥”，是一種藥食同源的中草藥[16]，目前已入選安徽十大皖藥，被衛(wèi)建委列入藥食同源試點(diǎn)品種。現(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕、明目增智及延緩衰老等功效[17]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分。因此對(duì)天麻糖苷類化合物代謝途徑酶基因的研究有利于提高天麻藥用植物資源的應(yīng)用價(jià)值。GTs在天麻糖苷類化合物合成過(guò)程中，起著至關(guān)重要的作用，目前在其他植物上已有廣泛的報(bào)道，然而，天麻中關(guān)于該基因的研究較少。本研究成功克隆了1條GeGT1，ORF全長(zhǎng)1 503 bp，編碼500個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為55 494.33。通過(guò)生物信息學(xué)分析該蛋白具有UDP-GTs的保守結(jié)構(gòu)域，屬于GTB型超家族。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-GeGT1，在大腸桿菌中誘導(dǎo)出可溶性蛋白，為進(jìn)一步研究GeGT1基因的體外功能奠定基礎(chǔ)。

GTs是一個(gè)功能多樣化的多成員基因家族，根據(jù)其氨基酸序列的相似性、底物特異性、反應(yīng)機(jī)制、反應(yīng)類型和三維結(jié)構(gòu)，將GTs分為97個(gè)家族（GT1～GT97），其中GT1是含有GTs數(shù)量最多的家族[18]。GTs主要包括2種空間結(jié)構(gòu)：GT-A和GT-B，GT1均采用GT-B折疊結(jié)構(gòu)。在植物細(xì)胞中，GT1主要對(duì)小相對(duì)分子質(zhì)量的大量生物活性天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，GeGT1屬于含有GT-B結(jié)構(gòu)的GT1家族。GeGT1能夠催化天麻素、巴利森苷等多種次生代謝產(chǎn)物的糖基化反應(yīng)，并且其通常是生物合成中的最后一步。通過(guò)對(duì)天麻不同部位化學(xué)成分研究表明[19]，天麻素及17種氨基酸和總氨基酸含量大小順序?yàn)榛ㄐ颍厩o＞根莖，與GeGT1在花和莖中的表達(dá)模式具有相似性。

在葡萄風(fēng)信子中，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因在根、鱗莖、葉、花中均有表達(dá)，在花中的表達(dá)量最高，在根、鱗莖和葉中微量表達(dá)[20]；在地黃中，地黃糖基轉(zhuǎn)移酶基因主要在葉和根中表達(dá)，在莖中的表達(dá)量偏低[13]，這與本實(shí)驗(yàn)得到的GeGT1基因組織表達(dá)特異性結(jié)果一致。以上研究表明GeGT1蛋白在不同植物的不同器官中具有不同的表達(dá)模式。本研究中對(duì)GeGT1基因的克隆及生物信息學(xué)分析彌補(bǔ)了蘭科藥用植物天麻GeGT1基因的空缺，建立了原核表達(dá)體系，為其在分子水平上的進(jìn)一步研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突