參芪扶正注射液通過調(diào)控miR-29b/Bcl-2通路逆轉(zhuǎn)胰腺癌多藥耐藥研究

文柳靜，張 潔

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，早期不易診斷，手術(shù)預(yù)后差[1]。2019年美國癌癥協(xié)會發(fā)布的數(shù)據(jù)表明，胰腺癌5年生存率為9%，是生存率最低的腫瘤[2]。目前，化療是治療胰腺癌的主要手段[3]。但是，腫瘤多藥耐藥的發(fā)生往往導(dǎo)致化療失敗。中藥可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌的化療耐藥，增加其敏感性[4-6]。隨著生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，大量研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）通過降解mRNA或抑制翻譯來調(diào)控基因表達(dá)，從而參與多種生物過程，影響腫瘤的發(fā)展、預(yù)后以及耐藥[7]。miRNA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[8]。miRNA-155通過提高抗凋亡因子的活性產(chǎn)生化療藥物的耐藥性，靶向miRNA-155能夠有效降低腫瘤細(xì)胞耐藥性[9]。過表達(dá)miRNA-145-5P能夠抑制胰腺導(dǎo)管腺癌PDAC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）表達(dá)，表明其與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)[10]。

本課題組前期研究結(jié)果顯示[11]，參芪扶正注射液能夠通過下調(diào)人胰腺癌 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）耐藥細(xì)胞株P(guān)atu8988/5-Fu多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）和Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)Patu8988/5-Fu細(xì)胞多藥耐藥。本研究考察參芪扶正注射液對miR-29b表達(dá)的影響以及miR-29b對Patu8988細(xì)胞增殖能力的影響，探討Patu8988/5-Fu耐藥細(xì)胞中miR-29b模擬物（miR-29bmimics）和miR-29b抑制劑（miR-29binhibitors）對Bcl-2蛋白表達(dá)的差異，為參芪扶正注射液逆轉(zhuǎn)胰腺癌多藥耐藥的機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu8988購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司

1.2 藥品與試劑

參芪扶正注射液（批號190934，250 mL/瓶）購自麗珠集團(tuán)利民制藥廠；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號8117203）購自美國Gibco公司；5-Fu（批號1801091）購自天津金耀集團(tuán)有限公司；特異性引物、Prime Script RT Master Mix和SYBR Premix EX Taq II購自日本 Takara公司；miR-29bmimics、miR-29binhibitors、FECT? CP轉(zhuǎn)染試劑購自廣州市銳博生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（批號9109）購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL超敏發(fā)光液（批號1815a01）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號8457S）、Bcl-2抗體（批號15071）購自美國CST公司。

1.3 儀器

PCR儀購自英國CorBett公司；ImageQuant LAS 4000 mini成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和耐藥細(xì)胞株的建立

Patu8988細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按課題組前期方法[11]建立Patu8988/5-Fu耐藥細(xì)胞株，將誘導(dǎo)成功的Patu8988/5-Fu細(xì)胞在含20 μg/mL 5-Fu的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取培養(yǎng)5代且處在對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 參芪扶正注射液對 Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響

將處于對數(shù)生長期的Patu8988/5-FU細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組和參芪扶正注射液（5、10、20 μL/mL）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24 h，收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：miR-29b上游引物5’-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3’，下游引物5’-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下 游 引 物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors對Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響

將處于對數(shù)生長期的Patu8988/5-FU細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時按照試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-29bmimics引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’；miR-29binhibitors引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’。轉(zhuǎn)染24 h后，按“2.2”項下方法檢測Patu8988/5-FU細(xì)胞中miR-29bmRNA表達(dá)情況。

2.4 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors對Patu8988細(xì)胞活力的影響

將處于對數(shù)生長期的Patu8988細(xì)胞，以4×104/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、miR-29bmimics組和miR-29binhibitors組，按照試劑盒說明書將miR-29bmimics和miR-29binhibitors分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)6 d，加入MTT，采用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處吸光度（A）值。

2.5 參芪扶正注射液對Patu8988/5-Fu細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

將處于對數(shù)生長期的Patu8988/5-FU細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、mimics陰性對照（NC mimics）組、miR-29bmimics組、miR-29bmimics＋參芪扶正注射液（20 μL/mL）組、抑制劑陰性對照（anti-miR-NC）組、miR-29binhibitors組、miR-29binhibitors＋參芪扶正注射液（20 μL/mL）組，按照試劑盒說明書將miR-29bmimics、miR-29binhibitors及相應(yīng)對照分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。加入裂解液，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Bcl-2、β-actin抗體（1∶1000），室溫孵育1 h后，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體（1∶200），室溫孵育1 h，加入ECL超敏發(fā)光液顯影，采用ImageQuant LAS軟件成像。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0軟件中單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 參芪扶正注射液對 Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，與對照組比較，參芪扶正注射液（20 μL/mL）作用于Patu8988/5-Fu細(xì)胞12 h，顯著上調(diào)miR-29bmRNA表達(dá)水平（P＜0.001）；參芪扶正注射液（5、10、20 μL/mL）作用于Patu8988/5-Fu細(xì)胞24 h，均顯著上調(diào)miR-29bmRNA表達(dá)水平（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖1 參芪扶正注射液作用12 h 和24 h 對Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells for 12 h or 24 h

3.2 轉(zhuǎn)染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors對Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，與NC mimics組比較，miR-29bmimics組miR-29bmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與anti-miR-NC組比較，miR-29binhibitors組miR-29bmRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-29b mimics (A) 和miR-29b inhibitors (B) 對Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29b mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of transfection of miR-29b mimics (A) and miR-29b inhibitors (B) on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells

3.3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors對Patu8988細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，與對照組比較，miR-29bmimics組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），miR-29binhibitors組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01），表明miR-29b能夠抑制Patu8988細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤作用。

圖3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors對Patu8988細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of miR-29b mimics and miR-29b inhibitors on viability of Patu8988 cells

3.4 參芪扶正注射液對Patu8988/5-Fu細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組比較，miR-29bmimics組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），miR-29bmimics＋參芪扶正注射液組Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05）；miR-29binhibitors組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-29binhibitors＋參芪扶正注射液組Bcl-2蛋白表達(dá)水平無明顯變化。

圖4 參芪扶正注射液對Patu8988/5-Fu細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on Bcl-2 expression in Patu8988/5-Fu cells

4 討論

參芪扶正注射液由黨參和黃芪配比而成，黨參多糖和黃芪中的多糖、皂苷、黃酮等成分均具有免疫調(diào)節(jié)作用。參芪扶正注射液對胰腺癌Mia-PaCa-2細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并能夠有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，其作用機制與調(diào)控多種相關(guān)基因、蛋白有關(guān)[12-15]。

miRNA是一類調(diào)控性的小分子非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)。miRNA參與腫瘤的多種生物學(xué)和生理過程[16-17]。miR-29b作為miRNA中的重要一員，發(fā)揮了重要的抑癌作用[18]。miR-29b具有調(diào)控多種下游信號通路和靶基因的作用[19-20]。miR-29b的靶基因是促凋亡因子Bcl-2修飾因子（Bcl-2 modifying factor，BMF），miR-29bmimics可以顯著降低BMF基因和蛋白表達(dá)水平[21]。過表達(dá)人單核白細(xì)胞系THP-1中miR-29b能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。miR-29b能夠抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移，Rhotekin蛋白（recombinant rhotekin，RTKN）可能是miR-29b調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的新靶點[23]。埃布爾森小鼠白血病病毒癌基因1（abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1，ABL1）和斷裂點簇集區(qū)（breakpoint cluster region，BCR）是miR-29b的靶點，過表達(dá)紅白血病K562細(xì)胞中miR-29b能夠抑制細(xì)胞生長和集落形成能力，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。紋蛋白4（striatin 4，STRN4）是miR-29b的靶點，下調(diào)miR-29b可以提高非小細(xì)胞肺癌NSCLC細(xì)胞中STRN4表達(dá)水平，調(diào)控miR-29b/STRN4通道可以抑制細(xì)胞增殖并延緩腫瘤擴(kuò)散[25]。miR-29b在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)miR-29b可以抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，可能為肺癌靶向藥物研發(fā)的一個新靶點[26]。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。上調(diào)Bcl-2/Bax可以抑制化療藥物引起的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的形成[27]。研究表明，miR-29b不僅參與細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且通過調(diào)控Bcl-2表達(dá)水平或Bcl-2/Bax，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[28-29]；miR-29b可以通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[30]；LINC00511通過miR-29b下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平并上調(diào)Bax表達(dá)水平，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)宮頸癌對紫杉醇的耐藥性[31]。本研究結(jié)果顯示，miR-29bmimics組Patu8988細(xì)胞活力顯著降低，miR-29binhibitors組Patu8988細(xì)胞活力顯著升高，表明miR-29b可以抑制Patu8988細(xì)胞增殖；參芪扶正注射液顯著上調(diào)Patu8988/5-Fu細(xì)胞miR-29bmRNA表達(dá)，miR-29bmimics顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平，miR-29binhibitors顯著升高Bcl-2蛋白表達(dá)水平，miR-29bmimics＋參芪扶正注射液組Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低。結(jié)合前期研究結(jié)果，參芪扶正注射液可以逆轉(zhuǎn)Patu8988/ 5-Fu細(xì)胞的耐藥性[11]，表明參芪扶正注射液通過調(diào)控miR-29b和Bcl-2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加Patu8988/5-Fu細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。

綜上所述，參芪扶正注射液可能通過調(diào)控miR-29b/Bcl-2通路從而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。miR-29b可能是參芪扶正注射液調(diào)控Patu8988/5-Fu耐藥細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的靶點，為深入研究參芪扶正注射液逆轉(zhuǎn)胰腺癌MDR的作用機制提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突