4種中藥注射劑改善大鼠慢性心力衰竭的藥效研究

翟 優(yōu)，劉思遠(yuǎn)，陳善夫，趙英強(qiáng)*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指慢性原發(fā)性心肌病變和心室因長期壓力或容量負(fù)荷過重，心肌收縮力不能維持心排血量，心臟收縮時(shí)心室不能完全充盈和充分泵血導(dǎo)致的疾病[1]。CHF是多種心血管疾病不斷發(fā)展的終末階段，其發(fā)病率和死亡率較高，長時(shí)間的心功能障礙降低了患者的生存質(zhì)量，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。目前臨床上主要以β受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和利尿劑等改善心功能、延緩和抑制心肌重構(gòu)，從而治療CHF，但由于適應(yīng)范圍窄、安全系數(shù)低等問題，療效不佳[4-5]。臨床研究表明，中西藥聯(lián)用治療CHF對(duì)于改善患者臨床癥狀、提高遠(yuǎn)期療效具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6]。中藥注射劑具有起效快、生物利用度高、無消化道吸收等特點(diǎn)，在輔助治療CHF中已得到廣泛認(rèn)可[7]。

中醫(yī)認(rèn)為CHF屬于“心悸”“水腫”“喘癥”等范疇，病位在心，進(jìn)而波及五臟，治則以“扶正祛邪”為主，因此補(bǔ)益類中藥注射劑在CHF的治療中得到廣泛應(yīng)用[8]。注射用益氣復(fù)脈、生脈注射液、參麥注射液和參附注射液是以紅參為君藥，麥冬或附子為臣藥的中藥注射劑[9]，具有擴(kuò)張冠脈、增加心肌供血、減少心肌耗氧量、去除氧自由基等藥理作用，是臨床治療CHF過程應(yīng)用較廣泛的4種補(bǔ)益類中藥注射劑[7,10-11]。因此，本研究選用以上4種中藥注射劑，觀察其改善大鼠CHF的療效，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠100只，8周齡，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物于溫度（23±1）℃、濕度30%～40%、12 h明暗循環(huán)的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行（TCM-LAEC2020038）。

1.2 藥品與試劑

生脈注射液（批號(hào)20032409，25 mL/支）、參附注射液（批號(hào)19120101001，10 mL/支）購自華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司；注射用益氣復(fù)脈（凍干）（批號(hào)20190314）購自天津天士力之驕藥業(yè)有限公司；參麥注射液（批號(hào)109027A1，10 mL/支）購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司；卡托普利片（批號(hào)19103113，25 mg/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；異氟烷（批號(hào)045742）購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-30882B）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-30639B）、和肽素（copeptin，CCP）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-30427B）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-34981B）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-34981B）、肌鈣蛋白（troponin，Tn）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-35135B）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-35234B）、超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，CRP）ELISA試劑盒（批號(hào)20200911-30078B）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20200724）購自南京建成生物工程研究所有限公司；鹽酸（批號(hào)20200604）購自北京世紀(jì)科博科技發(fā)展有限公司；無水乙醇（批號(hào)20200522）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Masson三色染色試劑盒（批號(hào)20190808）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

VME2TM小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國Matrx公司）；M9彩色多普勒獸用超聲診斷儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；ST16R離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite M200酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ASP300S全自動(dòng)脫水機(jī)、EG1150H包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)、HI1210展片機(jī)、HI1220烤片機(jī)（德國Lecia公司）；NIU顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 造模

取90只大鼠，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備大鼠CHF模型。用異氟烷麻醉劑行氣體麻醉，順肋間隙方向于肋骨左旁第3～4肋骨間撐開胸，暴露心臟，切開心包，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間可見左冠狀動(dòng)脈前降支起始部位，用520線縫針穿過左冠壯動(dòng)脈前降支，連同一小束心肌一起結(jié)扎，結(jié)扎后左心室壁變蒼白，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，徹底止血后逐層關(guān)胸，im抗生素。取10只大鼠作為對(duì)照組，僅將心臟外表面皮膚剪開后縫合，碘伏消毒。術(shù)后6周檢測(cè)心功能，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），將LVEF≤40%作為CHF模型成功的標(biāo)志[12]。

2.2 分組與給藥

將CHF大鼠隨機(jī)分為模型組、注射用益氣復(fù)脈（0.46 g/kg）組、生脈注射液（5.4 mL/kg）組、參附注射液（5.4 mL/kg）組、參麥注射液（5.4 mL/kg）組和卡托普利（3.67 mg/kg）組，每組15只?？ㄍ衅绽苡?.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.68 mg/mL的溶液；注射用益氣復(fù)脈溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.08 g/mL的溶液?？ㄍ衅绽Mig卡托普利溶液（5.4 mL/kg），其余各給藥組尾iv相應(yīng)藥物（5.4 mL/kg），對(duì)照組和模型組尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)2周。

2.3 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心功能的影響

給藥結(jié)束后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，于左前胸鎖骨下至肋骨下緣備皮，使用彩色多普勒獸用超聲診斷儀進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查[13]。經(jīng)多普勒超聲心動(dòng)圖在B型超聲左室長軸像引導(dǎo)下，于左室內(nèi)徑最大處（即乳頭肌水平）顯示M型超聲圖像，測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、左室舒張末容積、左室收縮末容積、左室二尖瓣舒張期E峰和A峰，計(jì)算LVEF、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和E/A，進(jìn)行心功能分析。

2.4 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影響

給藥結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫靜置30 min，3000 r/min離心20 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、LDH、IL-6和CRP水平。

2.5 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心臟組織病理變化的影響

給藥結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈放血處死，暴露胸腔，取出完整的心臟組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，切片（4～5 μm）后脫水，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察心臟組織病理變化。

心臟組織切片按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，膠原組織呈藍(lán)色，正常組織呈紅色，于顯微鏡下觀察心臟組織纖維化或膠原沉積程度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad prism 8.0進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心功能的影響

如圖1和表1所示，給藥后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟LVFS、LVEF、E/A均顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心臟LVFS、LVEF、E/A均顯著升高（P＜0.01），表明注射用益氣復(fù)脈、生脈注射液、參麥注射液、參附注射液、卡托普利能夠改善CHF大鼠心臟的射血能力和收縮能力。

表1 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心功能的影響Table 1 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on heart function of CHF rats

圖1 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心功能的影響Fig.1 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on heart function of CHF rats

3.2 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平均顯著升高（P＜0.01），表明大鼠出現(xiàn)心衰癥狀和炎性反應(yīng)；與模型組比較，注射用益氣復(fù)脈組大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），參麥注射液組和參附注射液組大鼠血清中BNP、CCP、IL-6和CRP水平顯著降低（P＜0.05、0.01），卡托普利組大鼠血清中BNP、CCP和IL-6水平顯著降低（P＜0.05），生脈注射液組各指標(biāo)呈降低趨勢(shì)，表明4種中藥注射劑可以不同程度地改善CHF大鼠的心臟功能和炎性反應(yīng)，其中注射用益氣復(fù)脈效果最佳。

表2 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影響Table 2 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on levels of ANP, BNP, CCP, Tn, CK-MB, IL-6, CRP and LDH in serum of CHF rats

3.3 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心臟組織病理變化的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠左心室心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，胞質(zhì)腫脹，部分心肌細(xì)胞核寬大畸形，心肌細(xì)胞間質(zhì)增加，炎性細(xì)胞浸潤；各給藥組上述病理變化明顯改善。如圖3所示，模型組大鼠左心室纖維組織增生，左心室壁極薄，多數(shù)心肌細(xì)胞為纖維組織替代；與模型組相比，各給藥組大鼠心肌纖維化面積減少，其中注射用益氣復(fù)脈、生脈注射液、參麥注射液優(yōu)于參附注射液。

圖2 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心臟組織病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.2 Effect of four kinds of Chinese medicine injections on pathological changes of heart tissue in CHF rats (HE, × 100)

圖3 4種中藥注射劑對(duì)CHF大鼠心臟組織病理變化的影響 (Masson, ×100)Fig.3 Effect of four kinds of Chinese medicine injections on pathological changes of heart tissue in CHF rats (Masson, × 100)

4 討論

心功能是指心臟的泵血機(jī)能。心臟即心泵，是推動(dòng)血液循環(huán)的動(dòng)力器官，通過其有規(guī)律的收縮和舒張，可將靜脈回心的血液射入動(dòng)脈，維持一定的心輸出量和動(dòng)脈血壓，保證身體各組織器官的血液循環(huán)[14]。LVFS、LVEF、E/A是衡量心功能的重要指標(biāo)，其中LVFS和LVEF是反映左心室收縮功能的常見參數(shù)，E/A是反映心臟舒張功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。本研究通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各給藥組大鼠LVFS、LVEF、E/A均顯著升高，表明注射用益氣復(fù)脈、生脈注射液、參麥注射液、參附注射液均可以顯著改善CHF大鼠心臟的射血能力、舒張和收縮能力，緩解心功能障礙，可能與4種補(bǔ)益類中藥注射劑均以紅參為君藥，且其中的人參皂苷成分具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、抗凋亡、增加血管灌流量等作用相關(guān)[16-17]。

血液中BNP、ANP、CCP、Tn、CK-MB、LDH水平與臨床患者心衰的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18]，左室壁的張力調(diào)節(jié)影響B(tài)NP分泌。BNP與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活呈拮抗作用，ANP是由心房合成、貯存和分泌的活性多肽，具有利尿、舒張血管、降低血壓和對(duì)抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素作用，能夠反映心臟衰竭的嚴(yán)重程度。此外，心力衰竭導(dǎo)致缺血心肌細(xì)胞中線粒體功能障礙，促進(jìn)活性氧生成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增加壞死、凋亡、纖維化和能量代謝異常[19-20]，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，血液中Tn、LDH和CK-MK水平顯著升高[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)注射用益氣復(fù)脈、生脈注射液、參麥注射液、參附注射液均能夠降低ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、LDH水平，其中注射用益氣復(fù)脈對(duì)各指標(biāo)的改善作用明顯優(yōu)于其他3種補(bǔ)益類中藥注射劑。與參麥注射液和參附注射液相比，注射用益氣復(fù)脈組方中具有五味子，五味子中五味子乙素、五味子丙素、五味子中總木脂素及五味子醇乙等成分均能夠通過促進(jìn)新生血管生成、抗炎和抗氧化等途徑發(fā)揮保護(hù)心臟和血管的作用[23]。且有研究表明注射用益氣復(fù)脈中的紅參、麥冬和五味子均為有效成分，且五味子對(duì)心功能和心肌酶等指標(biāo)均有改善作用[24]。

心臟功能受損可以使心臟炎性反應(yīng)增加，炎性細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)，繼而引起心肌細(xì)胞凋亡和壞死，CRP和IL-6是評(píng)價(jià)炎性反應(yīng)的重要指標(biāo)[25]。本研究結(jié)果顯示，注射用益氣復(fù)脈、參麥注射液和參附注射液能夠不同程度地降低心肌的炎性反應(yīng)；HE染色結(jié)果顯示，4種補(bǔ)益類中藥注射劑均能夠緩解CHF大鼠心臟左室炎性浸潤程度。心衰早期階段的炎癥過程中核因子-κB（nucleaur factor-κB，NF-κB）被激活[26]，后續(xù)本課題組將對(duì)4種補(bǔ)益類中藥注射劑通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路抑制炎性反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步明確其抑制炎癥的作用機(jī)制。

CHF導(dǎo)致的心肌損傷后，在缺血區(qū)域周圍形成缺血瘢痕，I型和III型膠原合成和降解不平衡，導(dǎo)致心肌纖維化，心肌的纖維化涉及心臟重塑，是典型的代償性肥厚或重塑過程[27-29]。Masson染色結(jié)果顯示，生脈注射液、參麥注射液、參附注射液及注射用益氣復(fù)脈能夠顯著降低CHF大鼠心臟的纖維化程度，HE染色結(jié)果也表明4種中藥注射劑明顯改善心肌細(xì)胞肥大、胞漿腫脹，炎性浸潤等病理變化，其具體如何緩解心肌組織的病理變化還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，4種補(bǔ)益類中藥注射劑均能夠顯著提高CHF大鼠的心功能指標(biāo)，降低心肌損傷指標(biāo)和炎性因子水平，減輕心肌纖維化程度，但4種中藥注射劑在改善心功能及心肌損傷方面的療效略有差異，可能與組方、作用機(jī)制等方面相關(guān)，后續(xù)本課題組將對(duì)其組方、作用機(jī)制差異等方面進(jìn)行深入研究和驗(yàn)證，進(jìn)一步明確造成4種補(bǔ)益類中藥注射劑藥效學(xué)差異的原因。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突