藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化消疹止痛凝膠提取工藝

郭 靜 ，玄振玉，岑 俊，謝 燕

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)公共健康學(xué)院，上海 201203

2.蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215125

3.上海建工醫(yī)院，上海 200083

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起的急性皰疹性皮膚病[1]，主要侵犯皮膚和局部神經(jīng)，常伴有劇烈疼痛[2]。中醫(yī)認(rèn)為，該病由外感濕熱毒邪火郁、氣血瘀滯所引發(fā)，故以清熱解毒、活血化瘀、通絡(luò)止痛為治療原則。諸多研究表明[3-5]，中醫(yī)藥在減輕皰疹癥狀及降低后遺神經(jīng)痛發(fā)生率等方面頗具特色和優(yōu)勢(shì)。消疹止痛凝膠（Xiaozhen Zhitong Gel，XZG）是來源于上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷、甘草6個(gè)藥味配伍而成。方中地龍清熱通絡(luò)為君；延胡索活血化瘀、行氣止痛，連翹、紫花地丁清熱解毒、涼血消腫為臣；白芷祛風(fēng)除濕為佐；甘草調(diào)和諸藥為使。全方配伍共奏解毒利濕、消疹止痛的功效。臨床研究表明，該方能加快皰疹皮損區(qū)結(jié)痂，并有效緩解帶狀皰疹急性期疼痛[6]。

該復(fù)方制劑有多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，療效確切，現(xiàn)將其轉(zhuǎn)化為中藥新藥，提高患者用藥可及性。提取工藝研究是保證中藥新藥安全有效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]，工藝路線直接影響其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，在中藥復(fù)方新藥研究中，常用化學(xué)指標(biāo)成分來確定其提取工藝路線，忽略與臨床療效的充分關(guān)聯(lián)[8-10]，故化學(xué)指標(biāo)成分作為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)有一定局限性。本實(shí)驗(yàn)擬采用藥效學(xué)指標(biāo)與化學(xué)指標(biāo)相結(jié)合的方式，對(duì)XZG的提取工藝進(jìn)行篩選、優(yōu)化。選用單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步篩選出具有抗病毒和止痛作用的提取工藝路線；再通過正交試驗(yàn)，以延胡索乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為指標(biāo)，考察該提取工藝的關(guān)鍵參數(shù)，從而確定XZG的提取工藝，為后期XZG的制劑工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，含四元泵，柱溫箱，DAD檢測(cè)器，Chemstation B.04.03工作站，美國Agilent公司；CP225D分析天平，十萬分之一級(jí)，德國Sartorius公司；S210型pH計(jì)，梅特勒-托立多儀器（上海）有限公司；DHG 9140A鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試劑與材料

延胡索乙素對(duì)照品，批號(hào)110726-201718，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，中國食品藥品檢定研究院；阿昔洛韋乳膏，福建太平洋制藥有限公司，批號(hào)180404；扶他林（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑），北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)X4775；乙腈為色譜純，美國Tedia有限公司；單純皰疹病毒液，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷和生甘草均購自亳州永剛飲片廠有限公司，產(chǎn)地分別為浙江、江蘇、河南、安徽、安徽和內(nèi)蒙古，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定，地龍為鉅蚓科動(dòng)物通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgarisChen的干燥體，延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)，紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensisMakino的干燥全草，白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.的干燥根，生甘草為豆科植物光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖；甘油購自浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司；卡波姆購自上海運(yùn)宏化工制劑輔料技術(shù)有限公司；經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國藥典》2015年版項(xiàng)下各項(xiàng)規(guī)定。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（19±1）g，合格證號(hào)11400700104571，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證SCXK（京）2015-0001；豚鼠，普通級(jí)，體質(zhì)量（300±20）g，合格證號(hào)11804800001841，北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證SCXK（京）2015-0005。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循小鼠和豚鼠有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選提取工藝路線

XZG原方采用乙醇浸漬提取后應(yīng)用于臨床，藥材提取效率差。生產(chǎn)中乙醇滲漉法提取效率高且與原工藝提取原理一致；考慮藥材提取時(shí)加熱可增加分子間運(yùn)動(dòng)，提高溶解度和提取效率，故增設(shè)乙醇回流提取作對(duì)比；另傳統(tǒng)中藥復(fù)方常以水為溶媒煎煮提取，安全經(jīng)濟(jì)；因此本實(shí)驗(yàn)擬選取乙醇滲漉、乙醇回流和水煎煮3種提取工藝路線進(jìn)行研究。

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起[11]，緩解急性期疼痛是XZG原方的臨床治療特色之一。針對(duì)以上2個(gè)主要藥效作用特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型進(jìn)行初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，比較3種提取工藝對(duì)皰疹癥狀的減輕程度和鎮(zhèn)痛作用的差異，以確定XZG的提取工藝路線。

2.1.1 樣品制備 按處方稱取粉碎后過10目篩的地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷和甘草各3份，按以下工藝進(jìn)行提取。

（1）乙醇滲漉提?。杭舆m量70%乙醇，以2 mL/min的體積流量滲漉提取，收集10倍藥材量的滲漉液，混勻。

（2）乙醇回流提取：加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液。

（3）水煎煮提?。杭?0倍量水煎煮2次，每次1 h，合并提取液。

將上述提取液濾過，濾液于70℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.07，備用；另取卡波姆、甘油加入適量的純化水中，攪拌使溶脹；分別將上述濃縮液加入溶脹的卡波姆中，攪拌均勻，以適量三乙醇胺調(diào)pH值至6.5，即得3個(gè)含藥凝膠（每克凝膠相當(dāng)于含生藥0.8 g）。取卡波姆、甘油，不加提取液，同法制得空白凝膠。

2.1.2 劑量設(shè)計(jì) 參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中“體表面積比”法換算動(dòng)物臨床等效劑量[12]，均勻涂抹動(dòng)物皮膚，以完全覆蓋為準(zhǔn)，測(cè)得豚鼠凝膠涂抹量為1.2 g/只（相當(dāng)于生藥3.2 g/kg），小鼠凝膠涂抹量為0.3 g/只（相當(dāng)于生藥12 g/kg）；阿昔洛韋軟膏豚鼠按1.2 g/只（相當(dāng)于生藥4 g/kg）涂抹，扶他林軟膏小鼠按0.15 g/只（相當(dāng)于7.5 g/kg）涂抹給藥。

2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示。如符合正態(tài)分布，進(jìn)行單因素方差分析，否則進(jìn)行K-W非參數(shù)檢驗(yàn)；單因素方差分析時(shí)，如方差齊性，采用LSD檢驗(yàn)，如方差不齊，采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。

2.1.4 對(duì)單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響

（1）分組和給藥：取豚鼠48只，按刺傷皮膚部位的破損程度分層隨機(jī)均分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、陽性（阿昔洛韋）組、3種提取工藝組，每組8只，雌雄各半。將豚鼠背部區(qū)皮膚脫毛（4 cm×4 cm）后，用梅花針深刺皮膚造成破損，模型組及各給藥組背部破損部位滴涂100 μL稀釋10倍的單純皰疹病毒液，對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)感染2 d。第1天感染后4 h各給藥組涂擦相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組涂擦空白凝膠，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

（2）觀察方法：于感染當(dāng)天開始觀察各組豚鼠背部病變情況，連續(xù)觀察12 d；按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表記錄分?jǐn)?shù)[13]（表1），將皮膚病變過程中所有分?jǐn)?shù)加在一起得到累積計(jì)分，同時(shí)記錄各組動(dòng)物的痊愈時(shí)間。

表1 單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of skin lesions in guinea pigs infected with herpes simplex virus

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見表2。與對(duì)照組相比，模型組豚鼠感染區(qū)皮膚紅腫明顯，并伴少量滲液，有不同程度的小皰疹出現(xiàn)或局部皮膚呈暗紅色，病變狀況明顯增加；且痊愈時(shí)間延長8 d，有顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，陽性組、乙醇滲漉組和乙醇回流組感染區(qū)病變明顯減輕：病變累積計(jì)分由（20.00±1.39）分分別減少至（14.25±1.56）分（P＜0.01）、（16.25±1.10）分（P＜0.01）、（18.44±1.52）分（P＜0.05）；痊愈時(shí)間由（11.75±0.46）d分別縮短至（9.25±0.71）d（P＜0.01）、（9.75±1.02）d（P＜0.01）、（10.88±1.15）d（P＜0.05），均具有顯著性差異；說明乙醇滲漉組和乙醇回流組對(duì)豚鼠皮膚皰疹病毒均有減輕作用，并可縮短痊愈時(shí)間，且乙醇滲漉組的作用效果更好。

表2 XZG不同提取物對(duì)單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響 (±s , n = 8)Table 2 Effects of different extracts from XZG on skin infection model of guinea pigs infected by herpes simplex virus (±s , n = 8)

表2 XZG不同提取物對(duì)單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響 (±s , n = 8)Table 2 Effects of different extracts from XZG on skin infection model of guinea pigs infected by herpes simplex virus (±s , n = 8)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 皮膚病變累積計(jì)分 痊愈時(shí)間/d對(duì)照 1.38±0.35 3.75±0.71模型 20.00±1.39## 11.75±0.46##陽性 14.25±1.56** 9.25±0.71**乙醇滲漉 16.25±1.10** 9.75±1.02**乙醇回流 18.44±1.52* 10.88±1.15*水煎煮 20.25±1.73 11.50±0.53

水煎煮組的皮膚病變計(jì)分和痊愈時(shí)間與模型組相比無差異，提示水煎煮組對(duì)豚鼠皮膚皰疹病毒無減輕作用。

2.1.5 對(duì)熱板致小鼠疼痛模型的影響

（1）篩選合格小鼠：恒溫水浴箱預(yù)先加熱至55 ℃，取ICR小鼠雌雄各半，每次1只放在熱板上，記錄小鼠出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間，即為該鼠的痛閾值，凡舔后足時(shí)間小于5 s或大于30 s或跳躍者棄之不用。

（2）分組和給藥：取合格小鼠50只雌雄各半，按基礎(chǔ)痛閾值分層隨機(jī)均分為5組，分別為模型組、陽性（扶他林）組、3種提取工藝組，每組10只。將小鼠背部區(qū)皮膚脫毛（2 cm×2 cm）后，各給藥組脫毛區(qū)涂抹給藥，模型組涂抹空白凝膠，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

（3）評(píng)價(jià)方法：分別于給藥后0.5、1、2 h測(cè)定小鼠痛閾值，如60 s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計(jì)算，連續(xù)觀察7 d。

（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見表3。給藥前各組小鼠痛閾值均在17 s左右，無顯著差異。給藥后0.5 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組和水煎煮組痛閾值分別較模型組延長約17、14、11、8 s，且均具有顯著性差異（P＜0.01）；說明給藥后0.5 h，陽性組、3種提取工藝組均可延長小鼠痛閾。給藥后1 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組痛閾值較0.5 h均有所延長，分別延長了4、3、2 s，而水煎煮組痛閾值則無增加；與模型組比較，陽性組和乙醇滲漉組痛閾值分別從（19.70±9.93）s延長至（38.20±14.94）s（P＜0.01）、（35.06±18.91）s（P＜0.05），具有顯著性差異，乙醇回流組和水煎煮組痛閾值雖然較模型組有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥后2 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組和水煎煮組痛閾值較1 h沒有增加；但與模型組比較，乙醇滲漉組和乙醇回流組痛閾值分別從（19.48±15.18）s延長至（33.64±14.38）s、（30.52±7.67）s，具有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，乙醇滲漉組在給藥后0.5、1、2 h均能夠顯著延長小鼠的痛閾值，表現(xiàn)出明顯的止痛作用。

表3 XZG不同提取物對(duì)熱板致小鼠疼痛模型的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effects of different extracts from XZG on pain model of mice induced by hot plate (±s , n = 10)

表3 XZG不同提取物對(duì)熱板致小鼠疼痛模型的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effects of different extracts from XZG on pain model of mice induced by hot plate (±s , n = 10)

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 痛閾值/s給藥前 給藥后0.5 h 給藥后1 h 給藥后2 h模型 17.02±2.34 17.71±15.04 19.70±9.93 19.48±15.18陽性 17.16±1.38 34.30±10.78** 38.20±14.94** 32.89±21.56乙醇滲漉 16.89±2.04 32.69±17.85** 35.06±18.91* 33.64±14.38*乙醇回流 17.25±2.16 28.68±19.82** 30.49±14.54 30.52±7.67*水煎煮 17.08±2.23 26.19±7.64** 25.49±22.12 23.73±16.90

綜合皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型2個(gè)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3種提取工藝中乙醇滲漉組的抗皰疹病毒和止痛作用效果最好。與原方臨床應(yīng)用時(shí)提取方式一致，另乙醇滲漉提取還可避免方中連翹苷、歐前胡素等化學(xué)成分受熱破壞而造成損失[14-15]。因此，確定采用乙醇滲漉法作為XZG的提取工藝。

2.2 正交試驗(yàn)法確定滲漉提取工藝參數(shù)

乙醇滲漉提取法主要通過不斷加入新鮮溶劑造成濃度差，形成動(dòng)態(tài)浸出，使有效成分提取完全，特別適用于遇熱不穩(wěn)定的成分提取，但該方法乙醇消耗量較大，耗時(shí)較長[16-17]。為獲得穩(wěn)定的提取工藝，并兼顧提取效率，取得成本最大效益比，本實(shí)驗(yàn)綜合提取過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)和因素，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定XZG乙醇滲漉法的提取工藝參數(shù)。

2.2.1 延胡索乙素含量的測(cè)定[18]

（1）色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-1.2%三乙胺溶液（45∶55）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為282 nm。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算不低于5000。

（2）對(duì)照品溶液的制備：取延胡索乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含延胡索乙素25 μg/mL的溶液，即得。

（3）供試品溶液的制備：稱取處方量的藥材，加適量70%乙醇，以2 mL/min的體積流量滲漉提取，收集8倍藥材量的滲漉液，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（4）陰性樣品溶液的制備：取缺延胡索的其他藥味按照供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液，即得。

（5）專屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間出峰，陰性樣品溶液對(duì)延胡索乙素的測(cè)定無干擾；以二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行純度分析，主峰的純度因子為998.7。對(duì)照品5次峰面積的RSD為1.4%，理論塔板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算為13 556，分離度3.1，符合系統(tǒng)適用性要求。

圖1 延胡索乙素對(duì)照品 (A)、XZG供試品 (B)、陰性樣品(C) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of tetrahydropalmatine reference substance(A), XZG sample (B), and negative sample (C)

（6）線性關(guān)系考察：分別精密量取延胡索乙素對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為251.2 μg/mL）1、2、5、10、25 mL分置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以延胡索乙素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝8.673 5x－18.664，r＝0.999 9，結(jié)果表明延胡索乙素在5.0～125.6 μg/mL線性關(guān)系良好。

（7）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，在0、4、8、12、18、24 h分別進(jìn)樣1次，記錄峰面積，結(jié)果延胡索乙素峰面積的RSD為1.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（8）重復(fù)性試驗(yàn)：制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL并計(jì)算質(zhì)量濃度。結(jié)果延胡索乙素的平均質(zhì)量濃度為0.032 mg/mL，RSD為1.7%，表明方法重復(fù)性良好。

（9）加樣回收率試驗(yàn)：取藥材9份，每份40 g，分別精密延胡索乙素對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為16.42 μg/mL）80、160、240 mL，平行3份，按供試品溶液制備方法制得滲漉液，搖勻，測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果延胡索乙素的平均回收率為96.6%，RSD為0.7%，表明方法準(zhǔn)確度高。

2.2.2 干膏得率的測(cè)定 量取提取液25 mL，置干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中，放冷，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。

2.2.3 指標(biāo)綜合評(píng)分法 方中延胡索具有活血化瘀、行氣止痛功效，延胡索乙素作為主要有效成分，藥理學(xué)研究顯示其具有明顯鎮(zhèn)痛作用[19]，選擇以延胡索乙素轉(zhuǎn)移率（Y1）為提取工藝研究的主要跟蹤指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.6；另外，干膏得率關(guān)系到制劑工藝、劑型的選擇及輔料的用量，以干膏得率（Y2）作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為0.4，采用綜合評(píng)分（Y）法對(duì)提取工藝進(jìn)行考察。

延胡索乙素轉(zhuǎn)移率＝提取液中延胡索乙素質(zhì)量/(延胡索藥材中延胡索乙素含量×所用延胡索藥材質(zhì)量)

干膏得率＝提取液總體積×干膏質(zhì)量/(取樣體積×藥材總質(zhì)量)

Yi＝(X1i/X1max×0.6＋X2i/X2max×0.4)×100

Yi表示第i個(gè)正交試驗(yàn)的綜合評(píng)分值，X1i表示第i個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果的延胡索乙素轉(zhuǎn)移率，X1max表示正交試驗(yàn)結(jié)果中延胡索乙素轉(zhuǎn)移率的最大值，X2i表示第i個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果的干膏得率，X2max表示正交試驗(yàn)結(jié)果中干膏得率的最大值

2.2.4 正交試驗(yàn)方法 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，影響滲漉工藝的主要因素為提取溶劑的濃度與用量、滲漉速度等，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、滲漉體積流量（B）、乙醇用量（C，以收集滲漉液的體積計(jì)）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，因素與水平表見表4。稱取處方量藥材共9份，照L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，控制滲漉體積流量進(jìn)行提取，收集相應(yīng)體積的滲漉液，濾過，即得。以提取液中延胡索乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表4、5。正交試驗(yàn)的直觀分析（表4）顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)、滲漉體積流量、乙醇用量3個(gè)因素的極差R值分別為88.9、4.9、8.3，表明3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序依次是A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（乙醇用量）＞B（滲漉體積流量）；K值表示各因素下3個(gè)水平分別對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響大小，K值最大則作為該因素的最優(yōu)水平，根據(jù)表4中K1、K2、K3大小分析得出，不同水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度依次是A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1，即各因素最優(yōu)水平分別為A1、B2、C3。

表4 滲漉提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment design and results of percolation extraction technology

方差分析（表5）結(jié)果顯示，因素A的F值為461.556 6，大于F0.01(2,2)＝99.00，說明A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著性影響（P＜0.01），結(jié)合直觀分析顯示的A1水平最優(yōu)，因此A因素選取A1水平，即滲漉提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。而B（滲漉體積流量）的F值為1.392 0、C（乙醇用量）F值為4.605 0，均小于F0.05(2,2)＝19.00，表明B和C因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無顯著性影響（P＞0.05）。

表5 滲漉提取工藝方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of percolation extraction technology

正交試驗(yàn)結(jié)果中綜合評(píng)分顯示，提取工藝為A1B2C2的評(píng)分最高，A因素為A1水平，與方差分析結(jié)果一致；B和C因素為B2、C2，均取各水平的中間值，從滲漉效率和節(jié)約溶劑角度考慮也較為合理。綜上，通過正交試驗(yàn)初步選擇提取工藝條件為A1B2C2，即60%乙醇滲漉提取，滲漉體積流量為4 mL/min，收集滲漉液體積為8倍藥材量。

2.2.6 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取2倍處方量藥材，平行3份，加入適量60%乙醇，以4 mL/min的體積流量進(jìn)行滲漉提取，收集8倍藥材量的滲漉液，計(jì)算延胡索乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，延胡索乙素平均轉(zhuǎn)移率為81.2%，RSD為0.5%；干膏平均得率為14.2%，RSD為0.7%；平均綜合評(píng)分值為97.8；結(jié)果表明，3次試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)綜合評(píng)分最大值相當(dāng)，且組間均無顯著性差異，表明該提取工藝參數(shù)A1B2C2合理可行，穩(wěn)定性較好。

表6 滲漉提取工藝方差分析結(jié)果Table 6 Comprehensive score results of percolation extraction technology

3 討論

進(jìn)行滲漉提取時(shí)，藥材粒度大小是重要的影響因素。粒度過大，滲漉時(shí)顆粒間隙大，導(dǎo)致溶劑消耗量大，且提取不完全；但顆粒過細(xì)會(huì)造成滲漉壓降過大，滲漉系統(tǒng)能耗過高，造成提取效率較低[20]。本實(shí)驗(yàn)在正交試驗(yàn)前，先以延胡索乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為指標(biāo)對(duì)藥材的粉碎粒度進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，藥材粉碎后分別過10、16、24目篩，延胡索乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率無顯著差異，但過10目篩的藥材滲漉效率高，不易發(fā)生堵塞，因此選擇將藥材粉碎過10目篩進(jìn)行滲漉提取。

XZG處方中不含貴重藥和毒性藥味，通常盡可能選擇君藥、臣藥中的藥效成分作為跟蹤指標(biāo)。方中地龍為君藥，其主要成分為蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類[21]，特征性專屬成分不明確，目前對(duì)含地龍中藥制劑的質(zhì)量控制研究較少，因此，未將地龍中的成分作為工藝跟蹤指標(biāo)。連翹和延胡索為方中臣藥，前期研究中發(fā)現(xiàn)，連翹中主要藥效成分連翹苷的陰性干擾較大，供試品制備方法復(fù)雜，不適宜作為指標(biāo)成分跟蹤工藝過程；而延胡索中的延胡索乙素為其特征性成分并具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，能夠體現(xiàn)工藝特點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選用延胡索乙素作為正交試驗(yàn)的指標(biāo)成分，優(yōu)化提取工藝。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突