基于DNA條形碼和礦物元素指紋的三文魚物種鑒定和產(chǎn)地溯源技術(shù)

王紫曄，王正亮，黃 玨，俞曉平

三文魚，學(xué)名大西洋鮭（Salmo salar），屬鮭科鮭屬魚類，因具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇、富含維生素、味道鮮美等諸多優(yōu)點而深受中國消費者喜愛[1]。由于三文魚是冷水洄游性魚類，其生存條件較為苛刻，因此我國暫無法大規(guī)模養(yǎng)殖，主要依賴進(jìn)口。近年來一些不法商家為牟取暴利，在三文魚魚肉及其制品的貿(mào)易過程中摻假、造假，以次充好。例如：2018年5月有媒體報道，國內(nèi)市場上近三分之一的進(jìn)口三文魚由青海龍羊峽產(chǎn)的虹鱒魚“承包”。而這些被媒體所曝光的恐怕也只是市場混亂現(xiàn)狀的冰山一角。如何加強(qiáng)進(jìn)口三文魚質(zhì)量安全管理，有效保障消費者權(quán)益，是當(dāng)前急需解決的問題，而建立三文魚真?zhèn)舞b別和產(chǎn)地溯源技術(shù)體系是解決上述問題的有效辦法。

在物種真?zhèn)舞b別領(lǐng)域中，基于DNA 的分子檢測是目前國際上最具權(quán)威的方法[2-4]。然而，隨著檢測需求的日益變化，現(xiàn)有方法（如基因芯片技術(shù)和分子指紋圖譜技術(shù)）在一定程度上存在操作程序耗時費力、鑒定結(jié)果精確性低等諸多不足[5-6]。DNA條形碼是以便捷、低廉的DNA 提取、擴(kuò)增和測序技術(shù)為前提的一項新興生物物種鑒定技術(shù)，它是通過一個標(biāo)準(zhǔn)化的短基因片段（即 “DNA 條形碼”）的序列變異來鑒定物種的，如動物線粒體細(xì)胞色素c 氧化酶亞基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）[7]。近年來，DNA 條形碼作為食品摻假、制假鑒別的關(guān)鍵技術(shù)已在食品貿(mào)易中廣泛應(yīng)用。如Khaksar 等[8]利用DNA 條形碼技術(shù)研究美國市售魚類，發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽錯誤率高達(dá)16.3%。Quinto等[9]使用DNA 條形碼方法對美國市場上的54 種野味樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有18.5%的樣品被貼錯標(biāo)簽，甚至其中9.3%的樣品為瀕危物種。

在產(chǎn)地溯源領(lǐng)域，近十多年來國際上主流的技術(shù)是基于礦物元素指紋圖譜和穩(wěn)定同位素質(zhì)譜檢測方法，同時結(jié)合以近紅外光譜、電子舌等為代表的現(xiàn)代無損分析模式，分別針對地理環(huán)境形成的礦物元素組成、同位素分布以及產(chǎn)品品質(zhì)差異等特征性指標(biāo)來判定產(chǎn)品的地理來源[10-12]。其中，礦物元素在某種程度上反映了動、植物的生長環(huán)境，可提供樣品地理來源特征信息，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源[13-15]。如Li 等[16]利用ICP-OES測定太平洋白蝦中Al、As、Ba、Ca、Co、Cr、Cu 等20種元素的含量作為分析變量，結(jié)合主成分分析等方法建立的判別模型能夠成功判別太平洋白蝦的地理來源。Zhao 等[17]通過礦物元素分析了馬尼拉蛤體內(nèi)礦物元素的組成，發(fā)現(xiàn)Mg、Cd、Sn、Ba、Ce 5種元素可作為馬尼拉蛤地域判別的有效指標(biāo)。

我國食品溯源研究還處于起步階段，目前相關(guān)研究主要集中于地理標(biāo)志性產(chǎn)品的保護(hù)，而在進(jìn)口食品質(zhì)量安全追溯中的應(yīng)用研究不多[18-20]。本文以進(jìn)口高附加值水產(chǎn)品——三文魚為對象，研究建立以DNA 條形碼技術(shù)為核心的三文魚真?zhèn)舞b別技術(shù)，評估礦物元素指紋圖譜技術(shù)在三文魚產(chǎn)地溯源應(yīng)用中的可行性，以期為建立和完善我國進(jìn)口水產(chǎn)品質(zhì)量安全識別體系提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中三文魚樣本購自浙江北極品水產(chǎn)有限公司，其中挪威三文魚樣本43 份，智利三文魚樣本42 份。為了保證研究材料的均一性，所有三文魚樣本均為帶皮魚身中段，質(zhì)量控制在1.0 kg/樣本左右。所有樣本置于-20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2 三文魚DNA 條形碼獲取及序列分析

1.2.1 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測序 三文魚基因組DNA 采用DNeasy Tissue Kit（Qiagen，Hilden，Germany）試劑盒抽提。取三文魚背部肌肉組織，置于研缽中，加入液氮充分碾磨后，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行DNA 提取，提取的基因組總DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用魚類DNA 條形碼通用引物FF2d（5’-TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG-3’）和FR1d（5’-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’）擴(kuò)增線粒體COI 基因序列[21]。PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，其中模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運行35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 終產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.2 公共序列下載、篩選及數(shù)據(jù)分析 從Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中下載與本研究擴(kuò)增區(qū)段一致的鮭科魚類COI 基因序列，通過比對BOLD 數(shù)據(jù)庫對序列準(zhǔn)確性進(jìn)行進(jìn)一步驗證。結(jié)合本研究所得的COI 基因序列，最終共獲得隸屬于29 種鮭科魚類的99 條基因序列（表1）。使用MEGA 6.0[22]進(jìn)行多序列比對，去除兩端冗余序列。分析處理后序列的核苷酸組成、變異位點及密碼子組成等?；贙imura-2-parameter（K2P）模型計算種間和種內(nèi)遺傳距離[23]，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1 000 次重復(fù)抽樣檢測其置信度。

表1 29 種鮭科魚類COI 基本信息Table 1 Information of COI sequences from 29 Salmonidae species

（續(xù)表1）

1.3 三文魚礦物元素組成測定及溯源分析

1.3.1 樣品預(yù)處理 三文魚中段魚肉切小塊后分裝冷凍于-80 ℃冰箱中備用。樣品處理方法參照郭波莉[24]的方法并做適當(dāng)調(diào)整，隨機(jī)取部分樣品置于烘箱70 ℃烘至恒重后，用陶瓷研缽和研杵將其研磨至魚粉。

1.3.2 礦物元素含量測定 準(zhǔn)確稱取0.3000 g 磨碎的魚粉，置于干燥消化管中，加入6 mL 濃硝酸（65%，分析純），置于MARS 微波消解儀（美國CEM 公司）中，通過逐步增加功率至1 600 W 并將溫度升高至185 ℃消化40 min。冷卻至室溫后加200 μL H2O2（30%，分析純）于消化管中，置于電熱消解儀中趕酸，趕酸溫度為160 ℃。最終得到約1 mL 的澄清透明溶液，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，用從Milli-Q 系統(tǒng)中獲得的超純水（18.2 MΩ·cm）定容至50 mL 待用。用Elan DRC-e 型ICP-MS（美國Pekin Elmer 公司）測定樣品中Cd、Ag、Pb、Fe、Cu、Zn、Al、Sr、Ni、As、Cr、V、Se 等13 種元素含量，使用OPTIMA 8000 ICP-OES（美國Pekin Elmer公司）測定樣品中Mn、K、Ca、Na 和Mg 5 種礦物元素的含量。用不含樣品的空白對照校正儀器讀數(shù)。每個樣品重復(fù)測量3 次，計算的每個值為3 次測定的平均數(shù)。

ICP-MS 工作條件：射頻功率1 300 W，霧化器氣體流速0.87 L/min，霧化室溫2 ℃。采用美國Agilent 公司的環(huán)境標(biāo)樣為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以內(nèi)標(biāo)元素Ge 和In 保證儀器的穩(wěn)定性。

ICP-OES 工作條件：射頻功率1 300 W，等離子氣體流速：15 L/min，輔助氣體流速：0.2 L/min，霧化器氣體流速：0.8 L/min，樣品流速：1.5 L/min。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、判別分析以及主成分分析。使用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行雷達(dá)圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三文魚DNA 條形碼的物種鑒別有效性評估

2.1.1 COI 基因片段序列分析 本研究PCR 所獲COI 序列及GenBank 下載序列共99 條，經(jīng)MEGA 6.0 軟件比對后，修剪成長度為561 bp 的共有片段進(jìn)行后續(xù)分析。結(jié)果顯示561 個位點中，保守位點368 個，可變位點193 個，簡約信息位點192個。在堿基組成上，A、T、G、C 的平均含量為分別為22.9%，30.1%，17.9%，29.1%。A+T 總含量為53.0%，C+G 總含量為47.0%。各密碼子的堿基含量結(jié)果顯示，第3 密碼子位點GC 含量（54.1%）顯著高于第1 和第2 密碼子位點（42.8%和44.3%），堿基使用頻率表現(xiàn)出明顯A+T 堿基偏向性。

2.1.2 遺傳距離分析 對COI 基因的K2P 遺傳距離分析結(jié)果表明，鈍吻細(xì)鱗鮭（Brachymystax tumensis）的種內(nèi)遺傳距離最大（0.0135），基氏白鮭（Coregonus kiyi）、霍氏白鮭（Coregonus hoyi）、銀鮭（Oncorhynchus kisutch）、遠(yuǎn)東哲羅魚（Parahucho perryi）、大西洋鮭（Salmo salar）、北極紅點鮭（Salvelinus alpinus）、北極茴魚（Thymallus arcticus）以及茴魚（Thymallus thymallus）等魚的種內(nèi)遺傳距離均為0，種內(nèi)平均遺傳距離為0.001。種間的遺傳距離介于0.002～0.229 之間，平均遺傳距離為0.150（表2）。種間平均遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)平均遺傳距離（約150 倍），滿足 “10 倍規(guī)則”，表明COI 基因作為DNA 條形碼能對29 種鮭科魚類進(jìn)行有效的物種鑒定[25]。

表2 基于COI 序列的鮭科魚類種內(nèi)及種間遺傳距離Table 2 Genetic divergences（K2P）at the species level for salmon taxa based on COI sequence

2.1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 基于29 種鮭科魚類99條COI 序列，利用鄰接法（Neighbor joining）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果顯示，同一物種的鮭科魚類均能聚集在同一分支內(nèi)，且均獲得較高的支持率。此外，屬級分類單元的單系性也得到了顯著體現(xiàn)，如鮭屬、白鮭屬、茴魚屬和大麻哈屬分別形成獨立的進(jìn)化分支，均表現(xiàn)為單系群。因此，基于NJ 樹構(gòu)建分析的方法亦表明COI 基因可以作為DNA 條形碼標(biāo)記有效區(qū)分本研究中的29 種鮭科魚類。

圖1 基于29 種鮭科魚類COI 序列構(gòu)建的鄰接樹Fig.1 The neighbour-joining trees analysis of 29 Salmonidae species based on K2P distances of COI

2.2 基于礦物元素指紋的三文魚產(chǎn)地溯源可行性分析

2.2.1 挪威和智利三文魚礦物元素含量差異 ICPMS 與ICP-OES 測定結(jié)果顯示，挪威和智利三文魚中Cd 與Ag 的礦物元素含量低于可檢測值。通過對其它16 種礦物元素含量進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果顯示Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 10 種礦物元素在地域間有顯著差異（表3）。部分元素的標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大，導(dǎo)致變異系數(shù)較大（如Mn、Sr、V等）。魚類體內(nèi)的礦物元素含量的影響因素有很多，例如飼料水平、年齡、性別、水中的礦物組成、捕撈季節(jié)等[26-30]，因而相同地域中三文魚體內(nèi)的礦物元素含量差異也會較大。

表3 挪威和智利三文魚的礦物元素含量Table 3 Mineral element content of Salmo salar from Norway and Chile

（續(xù)表3）

2.2.2 挪威和智利三文魚中礦物元素含量主成分分析 為探討礦物質(zhì)元素對三文魚產(chǎn)地判別的影響，以此建立判別模型，本研究對三文魚中地域間存在顯著差異的10 種元素進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1 的3 個主成分，由表4可知前3 個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為76.845%，可充分達(dá)到反映原始信息的目的。從主成分特征向量圖（圖2）中可以看出第1 主成分主要綜合了V、Fe、Cr、Ni、Zn 和Na 等6 種元素的含量信息，第2 主成分主要反映了Al 的含量信息，第3 主成分主要綜合了Se、Ca、As 等3 種元素的含量信息。

圖2 3 個主成分的特征向量雷達(dá)圖Fig.2 Characteristic vector radar diagram of three principal components

表4 主成分分析的特征向量及累計方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvector and cumulative variance contribution rate of principal components

2.2.3 挪威和智利三文魚中礦物元素含量判別分析 利用Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 等10種含量在地域間有顯著差異的礦物元素進(jìn)行線性判別分析。利用Fisher 函數(shù)、交叉檢驗進(jìn)行判別分析。將所有樣品分為訓(xùn)練集和驗證集，選擇2/3 的樣本作為訓(xùn)練集建立模型，1/3 的樣本作為驗證集，以驗證建立的溯源模型的準(zhǔn)確性。具體判別模型如下：

Y挪威=-84.010+0.184Fe+0.600Zn+0.193Al-1.290Ni+4.925As-0.089Cr-20.323V+17.449Se-0.721Ca+1.555Na

Y智利=-138.722+0.194Fe+0.873Zn+0.157Al-0.668Ni+4.283As-0.893Cr-24.471V+28.240Se-0.429Ca+0.962Na

利用上述判別模型對樣品歸類，由表5可以看出，此模型對三文魚產(chǎn)地來源的整體判別正確率為98.8%，交叉驗證結(jié)果的正確率亦為98.8%。說明Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 對三文魚產(chǎn)地的判別效果較好。

表5 挪威和智利三文魚礦物元素判別分析結(jié)果Table 5 Discriminant analysis results of mineral elements for Norwegian and Chilean salmon

3 結(jié)論

基于K2P 模型對8 屬29 種鮭科魚類的COI序列的遺傳距離分析顯示，平均種間遺傳距離為0.150，是平均種內(nèi)遺傳距離（0.001）的150 倍，表明各物種間具有明顯的物種邊界?；贑OI 基因序列以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中同一物種均單獨聚為一支。由此可見，基于COI 基因的DNA 條形碼技術(shù)能夠?qū)Ρ狙芯恐?9 種鮭科魚類有效實現(xiàn)“種”水平上的鑒定。礦物元素指紋分析顯示在挪威和智利進(jìn)口三文魚中礦物元素存在顯著性差異，其中Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 可作為鑒定其原產(chǎn)地的有效指標(biāo)?；谶@10 種礦物元素所建立的判別模型的正確判別率達(dá)98.8%，研究結(jié)果證明了礦物元素指紋是實現(xiàn)挪威與智利進(jìn)口三文魚產(chǎn)地溯源的有效方法。