激光輔助促釋技術(shù)快速分析鯊魚肝油精制過程的揮發(fā)性成分

宋恭帥，戴志遠(yuǎn)，2*，沈 清，2，朱蓓薇

鯊魚肝油是一種以鯊魚肝臟為原料，通過不同的提取方法制備的魚油，富含角鯊烯、烷氧基甘油及人體所需的必要微量元素，對各種皮膚病及癌癥有很好的防控作用，是主要的保健油脂[1]。目前，常見的油脂提取方法包括有機溶劑法、酶解法、淡堿水解法及蒸煮法等[2]。提取方法的原理主要是基于物理和化學(xué)的相互作用力，破壞肝臟組織結(jié)構(gòu)，促釋脂類物質(zhì)，并降低脂類物質(zhì)的表面張力與黏度，從而達到油脂分離的目的[3]。然而，在提取過程中，蛋白、類固醇、磷脂、色素及游離脂肪酸（FFA）等非油脂成分易混入原油中，影響油脂的感官性狀并破壞其穩(wěn)定性[4]。此外，原油中含有大量的不良?xì)馕冻煞忠自斐捎椭焚|(zhì)下降[5-6]。為了制備高品質(zhì)的魚油，需對粗制魚油進行精制處理。精制過程主要包括脫膠、脫酸、脫色和脫臭4 個工藝。脫膠的作用是將大量的膠質(zhì)類物質(zhì)去除，脫酸工藝主要是通過除去FFA 來達到降低油脂酸價的目的，脫色處理是指利用脫色劑的吸附作用將粗制魚油中痕量金屬及色素除去，脫臭的目的是將腥臭物質(zhì)盡可能地脫除[7-8]。有研究表明，粗制魚油精制過程中的每個工藝操作都會對其揮發(fā)性物質(zhì)組成造成影響[9]。在粗制魚油精制加工時，分析其揮發(fā)性成分變化具有重要意義。

分析樣品中的揮發(fā)性成分，首先需將揮發(fā)性物質(zhì)從中提取出來。常用的提取方法包括溶劑浸提法（SE）[10]、動態(tài)頂空吸附萃取法（DHS）[11]、同時蒸餾萃取法（SDE）[12]和頂空固相微萃取法（HSSPME）[9]等。鑒定揮發(fā)性成分的前提是將被測樣品中所含的揮發(fā)性物質(zhì)進行有效分離。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）分析法是目前樣品中揮發(fā)性物質(zhì)檢測中常用的萃取分離技術(shù)。該方法通常采用特定數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合相應(yīng)的保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品進行定性、定量分析[13]。宋恭帥等[8]采用HSSPME-GC/MS 技術(shù)分析5 種脫色劑對粗魚油中揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果表明脫色劑具有良好的吸附腥味物質(zhì)的作用。然而，傳統(tǒng)的HS-SPME-GC/MS 技術(shù)存在萃取頭使用壽命短，萃取與加熱時間長等問題[9]。針對上述問題，本課題組利用激光的促釋作用建立新型、簡便、高效的激光輔助頂空固相微萃取與GC/MS 聯(lián)用（LID HS-SPME-GC/MS）技術(shù)，優(yōu)化樣品添加量、照射時間、激光功率等參數(shù)條件，并通過方法學(xué)分析驗證其可行性。Song 等[14]基于LID HS-SPME-GC/MS 技術(shù)分析貽貝蒸煮液在真菌發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化。本研究采用LID HS-SPME-GC/MS 技術(shù)快速分析粗制鯊魚肝油精制過程中揮發(fā)性成分的變化，為優(yōu)化粗制油脂的精制工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗制鯊魚肝油，浙江海力生制藥有限公司；磷酸、檸檬酸、氫氧化鈉、無水甲醇（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3-甲基-3-丁烯醇、正構(gòu)烷烴（C5～C24），美國Sigma 公司；白土，河南振邦環(huán)?？萍加邢薰?。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace GC Ultra 氣相色譜與DSQ Ⅱ質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂層萃取頭，美國Supelco 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鯊魚肝油精制工藝 粗制魚油的化學(xué)精制工藝，即脫膠、脫酸、脫色與脫臭處理參照宋恭帥[7]的方法。

1.3.2 LID HS-SPME-GC/MS LID 條件：粗制鯊魚肝油樣品3 g，激光照射時間10 min，功率10 W[15]。

HS-SPME 條件：吸附時間同照射時間，即邊照射邊吸附。待吸附完全，抽出萃取頭，插入GC進樣口，于250 ℃條件下解吸3 min。

GC 條件：色譜柱型號TR-35 MS，規(guī)格30 m× 0.25 mm，0.25 μm；進樣模式：不分流；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；升溫程序：初溫40℃，保持3 min 后，以10 ℃/min 升至90 ℃，再以5℃/min 升至230 ℃，保持5 min。

MS 條件：離子源種類與溫度：EI，200 ℃；檢測器和傳輸線溫度：280 ℃和250 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍m/z 30～500。

1.3.3 化合物分析 采用3-甲基-3-丁烯醇（1 000 μg/mL，溶劑為無水甲醇）為內(nèi)標(biāo)物對各化合物進行定量分析，以正構(gòu)烷烴（C5～C24）的實際測量值校正保留時間。揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定主要是通過NIST 2.0 譜庫檢索分析。基于前期分析結(jié)果，僅保留正、反匹配度（SI/RSI）均大于800（最大值為1 000）的化合物。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 每個樣品平行測定3 次，平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和顯著性水平均采用SPSS 21.0 軟件計算，顯著性分析的置信區(qū)間為95%，用Microsoft Word、Origin 7.5 及Excel 繪制圖表。采用SIMCA 14.1 軟件處理磷脂數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鯊魚肝油精制過程中揮發(fā)性成分分析

采用LID HS-SPME-GC/MS 測定不同樣品中的揮發(fā)性成分，結(jié)果見表1。從粗制魚油、脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油中分別鑒定出40，34，31，28 和27 種揮發(fā)性物質(zhì)。粗制魚油中含有的雜質(zhì)最多，其中的揮發(fā)性物質(zhì)也最多[15]。魚油樣品中的揮發(fā)性成分主要分成烴類、醇類、醛類、酮類及其它類。如圖1所示，隨著粗制魚油精制的進行，各類揮發(fā)性組分的含量有顯著變化（P<0.05）。揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量與樣品整體風(fēng)味特征之間無直接關(guān)系，其對整體風(fēng)味的貢獻由其在風(fēng)味體系中的濃度和感覺閾值共同決定[16]。

表1 鯊魚肝油精制過程中揮發(fā)性物質(zhì)的含量變化（mg/kg，n=3）Table 1 The change in contents of volatile compounds in shark liver oil during refine process（mg/kg，n=3）

（續(xù)表1）

圖1 鯊魚肝油精制過程中揮發(fā)性物質(zhì)的含量變化Fig.1 The change in contents of volatile compounds in shark liver oil during refine process

粗制鯊魚肝油中醇類含量為4.50 mg/kg，在精制過程中醇類總含量有明顯下降，即在脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油中其含量分別為3.18，2.37，1.39，0.78 mg/kg。1-戊烯-3-醇為含量最高的醇類物質(zhì)，在粗制鯊魚肝油中的含量為1.32 mg/kg，而在脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油中分別僅為1.05，0.83，0.47，0.13 mg/kg。精制鯊魚肝油（脫臭魚油）較粗制鯊魚肝油中的1-戊烯-3-醇含量減少90.15%，說明精制的作用效果顯著。醇類化合物一般分為不飽和醇類和飽和醇類，其主要是因羰基化合物還原、脂肪酸二級氫過氧化物的降解以及氨基酸、糖類等的氧化還原作用而產(chǎn)生[9]。其中，不飽和醇類的感覺閾值較飽和醇類低，其對鯊魚肝油整體風(fēng)味特征的貢獻作用大。研究發(fā)現(xiàn)1-戊烯-3-醇主要是由游離氨基酸氧化脫氨基以及亞油酸的氫過氧化物降解形成的，其感覺閾值為400 μg/kg，有魚腥味，對樣品特征風(fēng)味的形成具有促進作用[17]。

醛類化合物是油脂中重要的芳香化合物，其閾值較低。在脂肪和含脂肪食品變質(zhì)過程中，醛類化合物可產(chǎn)生令人愉悅的香氣及腐臭的氣味[18]。本研究中，粗制魚油中含有8 種脂肪醛（戊醛、己醛、庚醛、辛醛、癸醛、壬醛、（E）-2-己烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛）及1 種芳香醛（對甲基苯甲醛），這些物質(zhì)可能由不飽和脂肪酸氧化降解后所形成的過氧化物的裂解產(chǎn)生，其中，壬醛含量最高（4.35 mg/kg），其是油酸的氧化產(chǎn)物，具有脂肪味、魚腥味，閾值為1 μg/kg。己醛的含量次之（3.14 mg/kg），己醛是亞油酸氧化酸敗的重要特征產(chǎn)物，具有魚腥味、青草味，且感官閾值低，僅為4.5μg/kg[19]。己醛、壬醛含量越高，粗制魚油中魚腥味越強烈。在精制過程中，壬醛的含量變化最為顯著（P<0.05）。脫膠魚油為3.46 mg/kg，脫酸魚油為2.73 mg/kg，脫色魚油為1.66 mg/kg，脫臭魚油為0.45 mg/kg，壬醛含量減少89.66%，說明精制工藝能有效除去粗制鯊魚肝油中的不良風(fēng)味物質(zhì)，尤其是最后的脫臭工藝作用效果最明顯，壬醛含量降低72.89%。

酮類化合物是一種重要的羰基化合物，其主要是脂質(zhì)自氧化和氨基酸降解的產(chǎn)物[20]。有研究發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸通過氫過氧化物的自氧化作用形成酮類化合物。鯊魚肝油中酮類化合物總含量占比最少，然而其感覺閾值較低，對魚油整體風(fēng)味的形成有較大影響。在檢測到的化合物中，2-壬酮、2-十一酮、2-癸酮、2-辛酮和2-庚酮的感覺閾值分別為5.5，7，35，50.3，140 μg/kg，這些酮類化合物具有脂香味、水果味、花香味等。其中粗制魚油中2-辛酮的含量最高，為1.78 mg/kg，對整體風(fēng)味的貢獻更大。而在脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油中的含量分別為1.63，1.41，1.05，0.56 mg/kg。研究結(jié)果表明，精制過程能有效去除酮類物質(zhì)。

油脂中烴類化合物主要是由長鏈非揮發(fā)性脂肪酸的脫羧作用形成。本研究發(fā)現(xiàn)鯊魚肝油中烴類化合物含量最高，在精制過程中各魚油樣品中烴類化合物的含量變化較為明顯。由于各種烴類（C8-C20）的閾值較高，因此可能不會在決定鯊魚肝油整體風(fēng)味中起到任何作用。另外，部分揮發(fā)性小分子含氧雜環(huán)化合物，如2.5-二甲基呋喃可能對整體風(fēng)味有輔助作用。2.5-二甲基呋喃具有溫和的豆香味，其含量在精制過程中逐漸減少。

2.2 多元回歸分析

2.2.1 主成分分析 主成分分析（Principal component analysis，PCA）是一種常用的數(shù)理統(tǒng)計方法，通過線性變換進行數(shù)據(jù)集簡化，可將具有相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為不相關(guān)，并稱該組不相關(guān)的變量為主成分[23]。本文采用Simca-p 14.1 軟件對80 個包括粗制魚油及經(jīng)脫膠、脫酸、脫色及脫臭處理后的樣品（每組樣品16 個重復(fù)）中揮發(fā)性成分進行PCA，結(jié)果如圖2所示。圖2a 為主成分得分圖，主成分1、2 的貢獻率分別為59.9%，20.5%，累計貢獻率達到80.4%，說明此模型的可靠性和預(yù)測度較好。80 個魚油樣品被分成有統(tǒng)計學(xué)意義的集群，即粗制魚油、脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油，分布在不同區(qū)域，且粗制魚油和其它4個精制處理樣品明顯被區(qū)分開，說明精制過程對鯊魚肝油中揮發(fā)性成分產(chǎn)生顯著影響。圖2b 為主成分荷載圖，在置信區(qū)間為95%的情況下，第1 主成分中1-戊烯-3-醇、己醛、壬醛、2-癸酮、庚醛、2-辛酮、2-壬酮等揮發(fā)性成分，即藍(lán)色圓圈中物質(zhì)所占的比重最大，說明這些變量對于形成第1 主成分的貢獻最大。結(jié)合表2中的顯著性分析表明這些揮發(fā)性物質(zhì)在區(qū)分樣品中起重要作用。主成分T 檢驗圖（Hotelling's T2plot）的主要作用是發(fā)現(xiàn)PCA 模型中的異常樣本，一般T2crit≤99%[24]。由圖2c 可知，本文中80 個樣品均為有效樣本。

2.2.2 正交偏最小二乘判別分析 為確定粗制鯊魚肝油在精制過程中的特征風(fēng)味物質(zhì)，本文在PCA 基礎(chǔ)上進行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least-square discriminant analysis，OPLS-DA）。OPLS-DA 是一種有監(jiān)督作用的判別分析統(tǒng)計方法，其主要目的是解釋觀測值并有效實現(xiàn)對相應(yīng)變量的預(yù)測[23]。對粗制魚油及4種精制魚油進行OPLS-DA 分析。圖2d 為S 曲線，相關(guān)系數(shù)大于0.8 的揮發(fā)性物質(zhì)為重要變量[25]。壬醛、辛醛、癸醛、戊醛、1-戊烯-3-醇、2-丁酮、2-辛酮、2-庚酮等均為重要變量。VIP（Variable importance for the projection）圖用于總結(jié)各變量的重要程度，一般地，VIP 值大于1 的變量稱為重要變量，而小于0.5 的則為不重要變量，介于1 和0.5 之間的為灰色區(qū)域，其重要性級別取決于數(shù)據(jù)集大小[26]。圖2e 中將各變量的VIP 值從大到小進行排列，共有23 個變量的VIP 值≥1。根據(jù)各重要變量的含量及感覺閾值，確定粗制鯊魚肝油在精制過程中的特征風(fēng)味物質(zhì)有2-十一酮、1-戊烯-3-醇、壬醛、2-壬酮、己醛、辛醛。圖2f 為置換驗證圖（Permutation test），其主要作用是通過模型擬合度（R2）和預(yù)測能力（Q2）來評價該統(tǒng)計模型的有效性[27]。該模型的R2=（0.0，0.0115）和Q2=（0.0，-0.191），說明具有良好的可行性。

圖2 多元回歸分析圖Fig.2 Multivariate statistical analysis

5 種魚油樣品中的主要揮發(fā)性物質(zhì)的熱圖分布見圖3。25 種樣品被聚類分析為兩大類，即粗制魚油與脫膠魚油為一類，其余3 組樣品為一類，說明酸法脫膠工藝對鯊魚肝油揮發(fā)性成分的作用效果不顯著。在其余3 組樣品中又可分為兩類，說明吸附脫色與真空脫臭工藝對魚油中不良風(fēng)味物質(zhì)的脫除效果很明顯。此外，熱圖分布結(jié)果與上述多元回歸分析結(jié)果一致，再次證明PCA 與OPLS-DA模型的有效性。

圖3 熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis

3 結(jié)論

粗制鯊魚肝油在精制過程中能將具有不良風(fēng)味的酮類、醛類、烴類及醇類等揮發(fā)性物質(zhì)脫除，使魚油整體風(fēng)味明顯改善。從粗制魚油、脫膠魚油、脫酸魚油、脫色魚油及脫臭魚油中分別鑒定出40，34，31，28 和27 種揮發(fā)性物質(zhì)。通過PCA 和OPLS-DA，確定2-十一酮、1-戊烯-3-醇、壬醛、2-壬酮、己醛、辛醛為主要特征風(fēng)味物質(zhì)。粗制鯊魚肝油的精制是一個連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)過程，每個操作步驟對油脂質(zhì)量與感官特性都有影響，而揮發(fā)性成分組成的不同直接影響油脂穩(wěn)定性，最終影響消費者的接受度。