?；撬釋UMS致抑郁小鼠的干預(yù)作用

張曉富，閆晨靜，周 茜，袁 靜，韓 雪，吳夢穎，王 頡，趙 文

近些年全球抑郁癥病例迅速攀升，嚴(yán)重威脅到人們的身心健康，人們對抑郁癥的關(guān)注度越來越高。抑郁癥又稱抑郁障礙，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率特征，臨床表現(xiàn)為心境低落、情緒的消沉，甚至有自殺的欲望[1-2]。全球抑郁癥患者已達(dá)3.22 億人[3]。目前臨床治療抑郁癥的大部分藥物都為單一機(jī)制的靶點藥物，僅能減輕部分患者的抑郁癥狀，而且此類藥物具有藥效延期的特性，抑郁癥狀嚴(yán)重的患者服用存在一定風(fēng)險。有些抗抑郁藥物還存在一定的副作用，會在一定程度上對患者心血管系統(tǒng)損傷。而一些特殊膳食成分，包括功能性營養(yǎng)素，對很多慢性疾病具有良好的干預(yù)和改善作用，因此，通過膳食補(bǔ)充劑干預(yù)抑郁的發(fā)生是目前的研究熱點。

?；撬崾且环N含硫非蛋白氨基酸，主要以游離形式出現(xiàn)在生物體內(nèi)[4]，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，是機(jī)體生理過程中必需的成分。大量的研究表明海魚、貝類等海生動物體內(nèi)均含有大量游離?；撬?，可用于直接提取天然?；撬醄5-7]。?；撬釋C(jī)體穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的生理功能至關(guān)重要[8-10]。近年來對于?；撬峁πё饔玫难芯坑泻芏啵▽凭愿螕p傷的干預(yù)作用[11]、降血壓[12]、緩解乙醇誘導(dǎo)的焦慮[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)?；撬峥捎行Ц深A(yù)利血平誘導(dǎo)的急性抑郁癥[14]，而有關(guān)牛磺酸對慢性抑郁的干預(yù)研究鮮有報道。本研究通過建立CUMS 誘導(dǎo)的慢性抑郁動物模型，探討天然牛磺酸對慢性抑郁的干預(yù)作用，為天然牛磺酸應(yīng)用于特醫(yī)食品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級ICR 小鼠，雄性，18～22 g，許可證號：SCXK（京）2009-0004，購自北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司。試驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 試驗材料與試劑

天然?；撬幔▉碓从谀迪牐兌取?9.9%，上?？刀∩锟萍加邢薰荆囼灂r以蒸餾水溶解。

所有生化指標(biāo)所用的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

1500-823型全波長掃描酶標(biāo)儀，Thermo Scientific 公司；無蓋敞箱（50 cm×50 cm×50 cm）；小鼠游泳水槽（15 cm×15 cm×20 cm）；Scientz-48 高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 CUMS 試驗設(shè)計 小鼠隨機(jī)分為6 組：陰性對照組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、陽性對照組（10 mg/kg bw 氟西?。?、天然?；撬岬?、中、高3 個劑量組（0.5，1，2 g/kg bw），每組8 只。

CUMS 造模方法：除陰性對照組外，其余各組小鼠每天灌胃1 h 后給予一種不可預(yù)知刺激，持續(xù)6 周。其中不可預(yù)知刺激主要包括：禁食（24 h）、禁水（24 h）、傾斜飼養(yǎng)（45°，24 h）、濕籠（灑150 mL 水在墊料上，24 h）、搖晃鼠籠（5 min）、夾尾（距尾根1 cm 處夾閉1 min）、持續(xù)光照（24 h）、冰水游泳（4 ℃，5 min）、晝夜顛倒[15]。

連續(xù)灌胃6 周，分別于第14，28，42 天進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳、曠場行為學(xué)實驗，并于42 d 記錄動物體重，收集血清，斷髓法處死動物，冰臺取腦組織并稱重。所有樣品-80 ℃保存，備用。

1.4.2 行為學(xué)指標(biāo) 試驗最后一次給藥1 h 后，進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳、礦場行為學(xué)實驗，具體方法為本實驗室建立，參照文獻(xiàn)[14]。

1.4.3 生化指標(biāo)測定 取出保存的血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒的方法要求測定ACTH、BDNF、T3、T4、TSH 和COR；取出腦組織，利用勻漿儀制備10%的生理鹽水組織勻漿，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒的方法要求分析5-HT、NE、DA、MAO、CRF含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋UMS 模型小鼠體重和腦重的影響

結(jié)果見表1。與陰性對照組相比，模型組小鼠體重降低顯著（P<0.05）。與模型組小鼠相比，陽性對照組小鼠體重出現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01），表明陽性藥物發(fā)揮作用，緩解了抑郁小鼠體重下降的趨勢。與模型組相比，天然牛磺酸各劑量組體重增加顯著（P<0.05），表明牛磺酸具有干預(yù)抑郁小鼠體重下降的功效。

表1 牛磺酸對CUMS 模型小鼠體重、腦重和腦指數(shù)的影響（±s，n=8）Table 1 Effects of taurine on body weight，brain weight and brain index in CUMS model mice（±s，n=8）

表1 ?；撬釋UMS 模型小鼠體重、腦重和腦指數(shù)的影響（±s，n=8）Table 1 Effects of taurine on body weight，brain weight and brain index in CUMS model mice（±s，n=8）

注：與陰性對照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01；與模型對照組相比，Δ：P＜0.05，ΔΔ：P＜0.01；與氟西汀對照組相比，#：P＜0.05，##：P＜0.01。

?組別 ?；撬釀┝?g·kg-1 bw 腦重/g 體重/g 腦指數(shù)/%陰性對照組 0 0.33±0.02 37.50±3.64Δ 0.88±0.10模型組 0 0.32±0.02 32.7±0.91*# 0.98±0.05氟西汀對照組 0 0.34±0.01 37.94±1.97Δ 0.94±0.72天然牛磺酸低劑量 0.5 0.33±0.02 37.38±2.81Δ 0.90±0.08天然?；撬嶂袆┝?1 0.33±0.01 36.69±1.94Δ 0.90±0.65天然?；撬岣邉┝?2 0.32±0.02 36.94±2.31Δ 0.88±0.60

與陰性對照組比較，試驗期間模型組、?；撬岣鲃┝拷M小鼠腦重未發(fā)生顯著性變化（P>0.05），表明抑郁癥對小鼠腦重影響不大。

與陰性對照組相比，模型組、?；撬岣鲃┝拷M腦/體比值均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）。

2.2 ?；撬釋UMS 模型小鼠懸尾不動時間的影響

如圖1結(jié)果所示。第14 天，模型組小鼠懸尾不動時間較其它組均有不同程度延長，但抑郁模型尚未形成。第28 天，與陰性對照組相比，模型組懸尾不動時間顯著升高（P<0.05），表明造模成功；與模型組相比，高劑量組相關(guān)指標(biāo)極顯著降低（P<0.01），低、中劑量組顯著降低（P<0.05），表明?；撬釋UMS 引起的小鼠懸尾不動時間延長的抑郁行為具有干預(yù)作用。第42 天，與模型組相比，中、高劑量組極顯著降低（P<0.01），表明在第42 天牛磺酸對CUMS 抑郁小鼠行為的改善效果比第28天更明顯，并且中、高劑量組的作用效果與陽性藥物相當(dāng)。

圖1 ?；撬釋σ钟粜∈髴椅膊粍訒r間的影響（s）（±s，n=8）Fig.1 Effects of taurine on tail immobility time of depression mice（s）（±s，n=8）

2.3 ?；撬釋UMS 模型小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間的影響

如圖2結(jié)果所示。第14 天，與陰性對照組相比，模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間顯著增加（P<0.05），表明造模成功；與模型組相比，中、高劑量組相關(guān)指標(biāo)顯著降低（P<0.05），表明?；撬釋UMS 導(dǎo)致小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間延長的抑郁行為具有干預(yù)作用。第28 天，與模型組相比，低、中劑量組相關(guān)指標(biāo)顯著降低（P<0.05），高劑量組極顯著降低（P<0.01），表明第28 天?；撬釋UMS抑郁小鼠行為的改善效果比第14 天更明顯。第42 天，與模型組相比，?；撬峤M均顯著降低（P<0.05），表明第28 天?；撬釋UMS 抑郁小鼠行為的改善效果最好，并且高劑量組與氟西汀對照組的作用效果相當(dāng)。

圖2 ?；撬釋σ钟粜∈髲?qiáng)迫游泳不動時間的影響（s）（±s，n=8）Fig.2 Effects of taurine on forced swimming immobility time of depression mice（s）（±s，n=8）

2.4 ?；撬釋UMS 模型小鼠曠場運動的影響

如圖3a 結(jié)果所示，第14 天，模型組小鼠水平運動次數(shù)較其它組均有不同程度的下降，但抑郁模型尚未形成。第28 天，與陰性對照組相比，模型組水平運動次數(shù)顯著降低（P<0.05），表明造模成功；與模型組相比，高劑量組相關(guān)指標(biāo)顯著增加（P<0.05），表明牛磺酸對CUMS 導(dǎo)致小鼠水平運動次數(shù)減少的抑郁行為具有干預(yù)作用。第42 天，與模型組相比，中、高劑量組相關(guān)指標(biāo)顯著增加（P<0.05），表明在第42 天?；撬釋UMS 抑郁小鼠行為的改善效果比第28 天更明顯，并且中、高劑量組的作用效果與陽性藥物相當(dāng)。

如圖3b 結(jié)果所示，第14 天，與陰性對照組相比，模型組垂直運動次數(shù)顯著降低，表明造模成功；與模型組相比，低、中劑量組相關(guān)指標(biāo)顯著增加（P<0.05），高劑量組極顯著增加（P<0.01），表明?；撬釋UMS 導(dǎo)致小鼠垂直運動次數(shù)降低的抑郁行為具有干預(yù)作用。第28 天和第42 天，與模型組相比，中劑量組顯著增加（P<0.05），高劑量組極顯著增加（P<0.01），表明第14，28，42 天?；撬釋UMS 導(dǎo)致的抑郁小鼠行為的改善效果相當(dāng)，并且作用能力呈劑量相關(guān)性，其中、高劑量組的作用效果與陽性藥物相當(dāng)。

圖3 牛磺酸對抑郁小鼠水平運動（a）和垂直運動（b）次數(shù)的影響（±s，n=8）Fig.3 Effects of taurine on horizontal movement（a） and vertical movement（b） times of depression mice（±s，n=8）

2.5 ?；撬釋UMS 模型小鼠5-HT、DA、NE的影響

如圖4結(jié)果所示，各劑量?；撬峤M的5-HT、DA、NE 均顯著高于模型組，其中中劑量組5-HT、DA、NE 和高劑量組DA 顯著增加（P<0.05），高劑量組的5-HT、NE 極顯著增加（P<0.01）。其中中、高劑量組作用較好，與氟西汀作用相當(dāng)。

圖4 ?；撬釋σ钟粜∈?-HT（a）、DA（b）、NE（c）水平的影響（ng/g）（±s，n=8）Fig.4 Effects of taurine on 5-HT（a），DA（b），NE（c） content in depression mice（ng/g）（±s，n=8）

2.6 牛磺酸對CUMS 模型小鼠MAO、BDNF 的影響

如圖5結(jié)果所示，各劑量?；撬峋蓸O顯著降低抑郁小鼠的MAO、升高BDNF 的水平（P<0.01）。表明牛磺酸對CUMS 導(dǎo)致的抑郁小鼠具有降低MAO、升高BDNF 的作用。與陽性藥物組對比，中、高劑量組未顯示出顯著性差異（P>0.05），表明牛磺酸中、高劑量組在降低MAO、升高BDNF作用上與陽性藥物相當(dāng)。

圖5 牛磺酸對抑郁小鼠MAO、BDNF 的影響（±s，n=8）Fig.5 Effects of taurine on MAO and BDNF in depression mice（±s，n=8）

2.7 ?；撬釋UMS 小鼠CRF、ACTH、COR的影響

如圖6結(jié)果所示，與模型組相比，牛磺酸各劑量組均極顯著降低CRF、ACTH 水平（P<0.01），中、高劑量組極顯著降低COR 含量（P<0.01）。與陽性藥物組對比，中、高劑量組未顯示出顯著性差異（P>0.05），表明?；撬嶂?、高劑量組在降低CRF、ACTH、COR 作用上與陽性藥物相當(dāng)。

圖6 ?；撬釋σ钟粜∈蟮腃RF（a）、ACTH（b）、COR（c）含量的影響（±s，n=8）Fig.6 Effects of taurine on CRF（a），ACTH（b） and COR（c） content in depression mice（±s，n=8）

2.8 ?；撬釋UMS 小鼠T3、T4、TSH 的影響

由圖7結(jié)果可知，與模型組相比，?；撬嶂袆┝拷MT3 含量和高劑量組T3、T4 含量均極顯著升高（P<0.01）；?；撬岬?、中、高各劑量組均極顯著降低TSH 水平（P<0.01）。表明?；撬釋UMS 抑郁小鼠具有升高T3、T4 含量，降低TSH 水平的作用。與氟西汀對照組相比，中、高劑量組在升高T3含量上作用與陽性藥物相當(dāng)，高劑量組在升高T4含量上作用與陽性藥物相當(dāng)，但所有劑量組均不能達(dá)到陽性藥物升高TSH 的作用水平。

圖7 ?；撬釋σ钟粜∈骉3（a）、T4（b）、TSH（c）含量的影響（±s，n=8）Fig.7 Effects of taurine on T3（a），T4（b） and TSH（c） content in depression mice（±s，n=8）

3 討論

目前廣泛使用的抑郁模型有應(yīng)激型和藥物誘導(dǎo)型兩大類，其中應(yīng)激抑郁模型通過模擬不可預(yù)知的應(yīng)激事件，增加模型與人類抑郁癥發(fā)病因素的相似性，使模型更加貼近人類抑郁發(fā)病機(jī)制，較好的模擬抑郁狀態(tài)，是目前公信度、可靠性最高的抑郁模型[16-18]。CUMS 模型可以增加小鼠懸尾不動和游泳不動時間，并引起曠場實驗中自主活動能力降低，減少水平、垂直運動次數(shù)，并能引起相關(guān)生理生化指標(biāo)出現(xiàn)與抑郁癥相同的改變[19-21]。

本文通過懸尾、強(qiáng)迫游泳及曠場實驗對?；撬岣深A(yù)CUMS 致慢性抑郁進(jìn)行了動態(tài)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第28 天小鼠CUMS 引起的抑郁模型建立成功，并且在第28 天發(fā)現(xiàn)?；撬釋UMS 導(dǎo)致的抑郁小鼠具有明顯干預(yù)抑郁行為的作用，其中中、高劑量的?；撬峥梢燥@著降低CUMS 模型小鼠懸尾不動和游泳不動時間，并提升曠場實驗中自主活動能力，增加水平、垂直運動次數(shù)，且存在劑量依賴。

抑郁癥是一種心理和生理的慢性應(yīng)激過程，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，迄今病因不明確。有關(guān)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有多種假說，其中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說作為公信度較高的學(xué)說，已經(jīng)通過大量研究得到驗證[15，22]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說認(rèn)為5-HT、DA、NE作為直接作用于神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度和功能的下降是抑郁癥產(chǎn)生的最直接原因，因此，抑郁癥的最主要表現(xiàn)就是腦內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸間隙5-HT、DA、NE 水平的下降[23-24]。本試驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然牛磺酸可以顯著提高患抑郁小鼠腦內(nèi)5-HT、DA、NE 水平，表明天然牛磺酸可能通過增加突觸間隙的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)來干預(yù)抑郁。

HPA 軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，參與控制應(yīng)激反應(yīng)。神經(jīng)內(nèi)分泌假說中HPA 亢進(jìn)學(xué)說認(rèn)為抑郁癥是由于腎上腺功能紊亂，負(fù)反饋機(jī)制被破壞而引起的。其作用機(jī)制是下丘腦分泌CRF 不斷升高，CRF 可作用于腦垂體前葉，促使機(jī)體內(nèi)ACTH 分泌增強(qiáng)，接著ACTH 再作用于腎上腺，最終導(dǎo)致COR 過度分泌[25]，COR 過度分泌會減少海馬神經(jīng)元的形成，最終影響海馬功能的發(fā)揮。而天然?；撬峥梢酝ㄟ^顯著降低CRF、ACTH、COR 的分泌來改善抑郁；但HPT 功能減退學(xué)說認(rèn)為由于機(jī)體的甲狀腺軸功能衰退，使血漿中T3、T4 水平顯著降低，TSH 升高，從而降低了抑郁癥發(fā)生的閾值，使機(jī)體在受到某些應(yīng)急刺激時抑郁癥更容易發(fā)生[26]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然牛磺酸可以顯著升高T3、T4 的水平，降低TSH 的含量來改善抑郁。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說則認(rèn)為BDNF 作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其各類型基因的表達(dá)與抑郁癥密切相關(guān)，BDNF 作為神經(jīng)營養(yǎng)因子參與血清素激活的神經(jīng)元的發(fā)育，所以血液中的BDNF 水平也可充分表明抑郁癥患者的抑郁程度[27-28]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過天然?；撬崴幬锾幚砗?，血液中BDNF 的含量顯著升高。綜上所述，?；撬崮芨纳朴蒀UMS 引起的小鼠抑郁行為。機(jī)制可能與相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)濃度和功能的下降、HPA軸功能紊亂、負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞以及甲狀腺功能衰退有關(guān)。

4 結(jié)論

1，2 g/kg bw 劑量的天然?；撬嵩诘?8 天可以改善小鼠的抑郁樣行為，并升高腦組織5-HT、DA、NE 含量，降低MAO 活性，升高BDNF、T3、T4含量，同時降低CRF、ACTH、COR、TSH 水平，從而干預(yù)CUMS 誘導(dǎo)的抑郁。并且試驗結(jié)果說明了?；撬釋σ钟舻母深A(yù)作用與HPA 軸假說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說密切相關(guān)，具體作用通路，以及牛磺酸的代謝產(chǎn)物與抑郁的關(guān)系需進(jìn)一步探究。