分子對(duì)接技術(shù)篩選鱸魚肌球蛋白中黃嘌呤氧化酶抑制肽

趙貴琴，李婷婷，宋敏杰，孫 宏，勵(lì)建榮*，謝 晶，鄧尚貴

痛風(fēng)作為一種常見的慢性病，其發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)。目前對(duì)于痛風(fēng)的治療方法主要有抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄兩種，其中抑制尿酸生成的藥的效果遠(yuǎn)高于促進(jìn)尿酸排泄的藥[1]。常用的抑制尿酸生成的藥，例如別嘌呤醇、非布司他這類化學(xué)藥物對(duì)腎臟有較大的副作用，不宜長(zhǎng)期使用[2]。開發(fā)生物活性成分作為黃嘌呤氧化酶抑制劑成為近年的研究熱點(diǎn)。例如：Li 等[2]從脫酚核桃水解產(chǎn)物、大豆水解產(chǎn)物和鰹魚水解產(chǎn)物中提取出黃嘌呤氧化酶抑制肽；姚蘭等[3]從大葉冬青中分離出了抑制黃嘌呤氧化酶的有效成分；Shi 等[4]從尖蕾狗牙花中分離出的生物堿成分也能較好地抑制黃嘌呤氧化酶。此外，高良姜[5]、鼠曲草[6]、蘆薈[6]、槲皮素[7]等植物源性前體物質(zhì)中都分離出可有效抑制黃嘌呤氧化酶作用的物質(zhì)。

嘌呤類物質(zhì)是引起痛風(fēng)的前體物質(zhì)，且黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）是人體尿酸代謝中的最后一個(gè)酶，該酶在治療高尿酸血癥及通風(fēng)方面受到廣泛關(guān)注。有研究指出可以通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性來減少尿酸的生成[8]。目前已報(bào)道許多植物源的黃嘌呤氧化酶抑制劑，如綠原酸[9]、黃酮類物質(zhì)[10]、白皮杉醇[11]、白藜蘆醇[11]、異丹葉大黃素[11]等，而動(dòng)物源性的黃嘌呤氧化酶抑制劑鮮有報(bào)道。本文選取鱸魚體內(nèi)的一種肌球蛋白作為研究對(duì)象。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度、分子大小、帶電性質(zhì)和配體特異性的分離方法分為四類[12]。其中根據(jù)溶解度的大小純化蛋白可以用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和低溫有機(jī)溶劑沉淀法；根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小可以用透析、超濾和凝膠過濾法；根據(jù)帶電性質(zhì)可用電泳法和離子交換層析法；根據(jù)配體特異性分離可以用親和色譜法[13-16]。傳統(tǒng)的蛋白純化方法具有過程繁瑣、歷時(shí)長(zhǎng)，且得到的產(chǎn)物純度低、產(chǎn)量小等缺點(diǎn)。分子對(duì)接技術(shù)可以縮短蛋白純化過程所需時(shí)間，并可很好地篩選出所需的多肽，對(duì)多肽進(jìn)行生物活性預(yù)測(cè)及試驗(yàn)驗(yàn)證，得出效果良好的多肽。呂靖[17]通過分子對(duì)接技術(shù)篩選到可以抑制脲酶活性的抑制劑，尿素的快速水解會(huì)引起氨的非生產(chǎn)性揮發(fā)，造成局部環(huán)境pH值的升高，給環(huán)境和人體帶來負(fù)面影響，通過篩選脲酶抑制劑以緩解對(duì)環(huán)境和人體造成的危害。樊玥[18]利用分子對(duì)接技術(shù)將三肽與黃嘌呤氧化酶對(duì)接，篩選出其中具有較強(qiáng)ACE 抑制效果的三肽。Palakurti 等[19]利用虛擬篩選、3D 建模篩選出β-分泌酶抑制劑，這類酶抑制劑可以有效緩解阿爾茲海默癥。Wu 等[20]利用分子對(duì)接技術(shù)成功地從甜高粱籽粒酶解產(chǎn)物中篩選出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，開發(fā)預(yù)防高血壓的新型產(chǎn)品。

綜上所述，本文將利用虛擬酶解、分子對(duì)接，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方法，從鱸魚肌球蛋白中篩選可有效抑制黃嘌呤氧化酶的多肽。通過合成這些多肽，并體外抑制試驗(yàn)驗(yàn)證，最終獲得具有良好黃嘌呤氧化酶抑制效果的肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚肌球蛋白氨基酸序列，來自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白數(shù)據(jù)庫[21]：Myosin-7B （Myosin heavy chain 7B，cardiac muscle beta isoform） [Dicentrarchus labrax]1936 aa protein。

別嘌呤醇結(jié)構(gòu)，來自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫[21]。

黃嘌呤氧化酶，北京索萊寶科技有限公司；黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)），上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸（色譜級(jí)），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗超氧陰離子試劑盒，南京建成生物工程研究所；四丁基氫氧化銨離子對(duì)試劑（色譜級(jí)），上海邁瑞爾公司；活性肽（純度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀島津LC-2030，日本島津公司；電子分析天平MS105DU，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；渦旋混合器XH-T，金壇區(qū)白塔新寶儀器廠；電熱恒溫水槽DK-8D，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；Discovery Studio 2017 R2 Client，美國(guó)Accelrys 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 虛擬酶解 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索鱸魚肌球蛋白可以得到Myosin-7B （Myosin heavy chain 7B，cardiac muscle beta isoform）[Dicentrarchus labrax]，該肌球蛋白來自鱸魚心肌，共有1 936 個(gè)氨基酸。將該蛋白通過網(wǎng)站（https：//www.expasy.org/）PeptideCutter[22]進(jìn)行虛擬酶解。其中所使用的酶為低特異性的胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶，通過這3 種酶的共同作用將上述蛋白質(zhì)水解為多肽鏈，然后根據(jù)需要選擇四肽、五肽和六肽。

1.3.2 分子對(duì)接 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB（http：//www.rcsb.org/）[18]中獲取黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD） 的3D 結(jié)構(gòu)，從中檢索到了1FIQ——一種從牛乳中獲取的黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)。受體蛋白1FIQ 共有6 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，主要位點(diǎn)為：Fe2S2（無機(jī)）團(tuán)簇（FES）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、二氧鉬離子（MOS）。根據(jù)文獻(xiàn)記載，F(xiàn)AD 苯并咪唑類似物對(duì)XOD 具有非競(jìng)爭(zhēng)性、不可逆抑制作用[23]，因此，在本次分子對(duì)接過程中選擇FAD 結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)合位點(diǎn)共有12 個(gè)氨基酸殘基結(jié)合位點(diǎn)：Asp360、Val259、Asn351、Val342、Phe337、Thr262、Glu263、Ile264、Gly350、Ser347、Leu257、Leu404，在該結(jié)合位點(diǎn)處能與這些氨基酸殘基結(jié)合，則有能抑制XOD 的可能性。同時(shí)用篩選出的多肽與黃嘌呤位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

將得到的XOD 晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio 2017 R2 Client（DS2017），并對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接前的去水加氫原子等一些準(zhǔn)備操作。將上一步得到的多肽在DS2017 軟件中進(jìn)行3D 建模，將其作為配體進(jìn)行能量最小化。

以1FIQ 作為受體蛋白，以虛擬酶解的多肽為配體，以（X：32.366，Y：17.515，Z：111.022）為對(duì)接中心，以7.2 為對(duì)接半徑進(jìn)行分子對(duì)接。采用Dock Ligands 中的半柔性對(duì)接LibDock 進(jìn)行分子對(duì)接，并且設(shè)置參數(shù)為剛性優(yōu)化、快速篩選，其余設(shè)置為默認(rèn)值進(jìn)行分子對(duì)接。按打分將篩選出的多肽進(jìn)行下一步操作。

1.3.3 藥物代謝動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè) 利用Discovery Studio 2017 R2 Client 進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)（ADMET）的預(yù)測(cè)，進(jìn)一步篩選多肽。ADMET 是對(duì)藥物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性進(jìn)行全面的研究[24]，ADMET 性質(zhì)研究主要以人源性或人源化組織功能性蛋白質(zhì)為“藥靶”，將體外研究技術(shù)與計(jì)算機(jī)模擬等方法相結(jié)合[25]，研究藥物與體內(nèi)生物物理和生物化學(xué)屏障因素間的相互作用，為體外篩選XOD 抑制劑提供了良好的基礎(chǔ)。

1.3.4 黃嘌呤氧化酶抑制效果驗(yàn)證 通過高效液相色譜法進(jìn)行活性驗(yàn)證，以黃嘌呤轉(zhuǎn)化量反映酶活性變化，用1 mL 黃嘌呤（200 μL/mL）與50 μL黃嘌呤氧化酶（0.1 U/mL）反應(yīng)作為空白對(duì)照，在反應(yīng)體系中分別加入 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0 mg/mL 的多肽1 mL，根據(jù)加入多肽后對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系中黃嘌呤的轉(zhuǎn)化量的影響確定其抑制作用，整個(gè)反應(yīng)體系在35 ℃下反應(yīng)20 min，隨后加入20 μL 鹽酸（1 mol/L）作為反應(yīng)終止劑。色譜條件根據(jù)任麗琨等[26]的研究并稍有改變，色譜條件為：柱溫45 ℃，流動(dòng)相=V甲醇∶V混合液（V水∶V冰乙酸∶V四丁基氫氧化銨=997∶1.5∶1.5）=5∶95，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL 進(jìn)行等度洗脫檢測(cè)。

超氧陰離子檢測(cè)按照試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，用超氧陰離子試劑盒檢測(cè)XOD 氧化黃嘌呤或次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的過程中產(chǎn)生的超氧陰離子O2-。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸魚肌球蛋白虛擬酶解結(jié)果

從NCBI 中獲得一條有1 936 個(gè)氨基酸的鱸魚肌球蛋白。肌球蛋白是鱸魚體內(nèi)的主要蛋白之一，并且具有可靠的氨基酸序列。利用Peptide Cutter 模塊，并選擇其中的低特異性的胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶3 種酶的組合作用于鱸魚肌球蛋白。因?yàn)殡逆溸^長(zhǎng)的多肽不容易與XOD 的活性位點(diǎn)結(jié)合，因此選擇氨基酸較少的肽鏈，根據(jù)需要篩選了所需肽鏈，共得到三肽100 條、四肽45 條、五肽39 條、六肽33 條，具體結(jié)果如表1所示。

表1 鱸魚肌球蛋白虛擬酶解結(jié)果Table 1 Results of virtual enzymatic hydrolysis of myosin in bass

2.2 多肽與黃嘌呤氧化酶的分子對(duì)接結(jié)果

黎青勇[27]已經(jīng)研究了抑制XOD 的三肽，因此本文主要對(duì)四肽、五肽、六肽進(jìn)行研究。分子對(duì)接可以通過研究分子間相互作用從而預(yù)測(cè)分子間的結(jié)合方式，因而被廣泛用于抑制劑的篩選。

受體蛋白1FIQ 共有6 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，主要活性位點(diǎn)為：Fe2S2（無機(jī)）團(tuán)簇（FES）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、二氧鉬離子（MOS）。根據(jù)文獻(xiàn)記載FAD 苯并咪唑類似物對(duì)XOD 具有非競(jìng)爭(zhēng)性、不可逆抑制作用[27]，因此，在本次分子對(duì)接過程中選擇FAD 結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)合位點(diǎn)共有12 個(gè)氨基酸殘基結(jié)合位點(diǎn)：Asp360、Val259、Asn351、Val342、Phe337、Thr262、Glu263、Ile264、Gly350、Ser347、Leu257、Leu404，在該結(jié)合位點(diǎn)處能與這些氨基酸殘基結(jié)合，則有抑制XOD 的可能性。同時(shí)用篩選出的多肽與黃嘌呤位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 1FIQ（左）及FAD 配體（右）Fig.1 1FIQ （left） and FAD ligand （right）

2.2.1 ADMET 及分子對(duì)接結(jié)果 根據(jù)分子對(duì)接的打分結(jié)果分別選擇出3 種多肽打分最高的10條多肽并對(duì)這30 種多肽進(jìn)行了ADMET 預(yù)測(cè)。如表2所示，所有多肽水溶性良好且都未顯示出TOPKAT 毒性以及肝毒性，這表明打分較高的這些肽對(duì)人體有害的可能性較小[28]，雖然穿透血腦屏障的可能性不明確，但是由于其吸收率低可以猜測(cè)其對(duì)血腦屏障的穿透力也極低，可忽略不計(jì)。綜上所述，ADMET 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示了人體友好型多肽。

表2 ADMET 及分子對(duì)接結(jié)果Table 2 ADMET and molecular docking results

根據(jù)表3所示內(nèi)容，在ADMET 預(yù)測(cè)中只有血漿蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示出了差異性，其中EADR、QSSR、ADVDR、NEAVR、NEISTR 的預(yù)測(cè)結(jié)果中顯示其與血漿蛋白的結(jié)合能力高于90%，表明這5種多肽與血漿蛋白的結(jié)合能力可能高于目標(biāo)酶，即不能到達(dá)目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)[30]，因此，這5 種肽不能用于接下來的活性驗(yàn)證過程。

表3 ADMET 賦分參考表[28-29]Table 3 ADMET scoring reference table[28-29]

在ADMET 預(yù)測(cè)性能相差不大的情況下，選擇分子對(duì)接打分較高的3 種多肽進(jìn)行分子對(duì)接的進(jìn)一步結(jié)合分析以及活性驗(yàn)證，有文章指出芳香族氨基酸殘基，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸這4 種氨基酸的多肽，更有利于抑制XOD[27]，因此選擇選擇五肽EQEEY 進(jìn)行驗(yàn)證。最終選擇四肽DIDH、五肽EQEEY、六肽DEEIDN 進(jìn)行接下來的分析。

2.2.2 多肽抑制XOD 機(jī)理 多肽需要與XOD 結(jié)合后，才能產(chǎn)生正向或反向的結(jié)果，基于此分析DIDH、EQEEY 和DEEIDN 在分子對(duì)接過程中與XOD 形成的結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行分析。該過程中用已知的XOD 抑制劑別嘌呤醇作為對(duì)照，并對(duì)篩選出的3 個(gè)多肽與XOD 的結(jié)合方式與別嘌呤醇與XOD 的結(jié)合方式進(jìn)行對(duì)比分析。

（續(xù)表2）

圖2為3 種多肽與XOD 結(jié)合后的2D 可視化分析。圖2a 為已知的XOD 抑制劑別嘌呤醇，以它為對(duì)照來分析篩選出的3 種肽與XOD 的結(jié)合，從而推斷3 種肽是否有抑制XOD 的潛力。別嘌呤醇與XOD 的氨基酸殘基Gly265、Asn261、Gly350 之間形成范德華作用力，與XOD 的氨基酸殘基Glu263、Leu257、Thr262、Ser347 形成氫鍵作用力，與XOD 的氨基酸殘基Val258 和Ile264 之間形成疏水相互作用。別嘌呤醇通過與XOD 的這些氨基酸殘基相互作用結(jié)合，從而產(chǎn)生抑制效果。圖2b為DIDH 與XOD 的相互作用模式圖，其中DIDH與XOD 的氨基酸殘基 Glu267、Thr262、Leu305、Lys256、Ala302、Leu287、Pro281、Leu245、Glu402、Lys249 之間形成范德華力，與XOD 的氨基酸殘基Ile264、Gly260、Asn261、Val259、Glu263、Ser347、Gly350、Gly349、Ala301、Leu404 之間形成氫鍵相互作用，與XOD 的氨基酸殘基Leu257、Leu398、Ile403、Ala346、Ile353 之間形成疏水相互作用。圖2c 為EQEEY 與XOD 的相互作用模式圖，EQEEY與XOD 的氨基酸殘基 Asn351、Gly350、Glu267、Ser347、Val345、Gly260、Leu257、Pro253、Glu254、Ala255、Ile353、Gly399、Pro400、Leu397、Lys395、Ser392 之間形成范德華力，與XOD 的氨基酸殘基Val259、Glu263、Ile264、Arg394、Leu398、Thr396 之間存在氫鍵作用，與XOD 的氨基酸殘基Ala346之間產(chǎn)生疏水相互作用。圖2d 為DEEIDN 與XOD 的相互作用模式圖，DEEIDN 與XOD 的氨基酸殘基 Val345、Leu404、Gly349、Thr354、Ile353、Ala346、Val342、Ile264、Asn331、Phe337、Leu305、Gly265、Val258、Pro400、Gly399、Glu402、Lys249、Ile403、Arg394 形成范德華作用力，與XOD 的氨基酸殘基Thr262、Asn261、Ser347、Gly260、Thr396、Leu257、Val259、Lys256 形成氫鍵相互作用，與XOD 的氨基酸殘基Leu398 形成疏水相互作用。

圖2 別嘌呤醇-XOD（a）、DIDH-XOD（b）、EQEEY-XOD（c）、DEEIDN-XOD（d）FAD 結(jié)合位點(diǎn)2D 模式圖Fig.2 2D pattern diagram of FAD binding sites of Allopurinol-XOD （a），DIDH-XOD （b），EQEEY-XOD （c），DEEIDN-XOD （d）

3 種肽與XOD 的氨基酸殘基結(jié)合情況可以看出，DEEIDN 與XOD 的結(jié)合最為穩(wěn)固，不僅作用的氨基酸數(shù)量最多，而且形成氫鍵的數(shù)量也多，DEEIDN 相比于其它兩種肽，與重要氨基酸殘基的結(jié)合量是4，是3 種肽里最多的，所以預(yù)測(cè)DEEIDN 將擁有最好的XOD 抑制活性。DIDH 的氫鍵形成數(shù)量是10，是3 種肽里形成氫鍵最多的肽，因此與XOD 形成了最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[31]，但是由于其氨基酸數(shù)量是3 種肽里最少的，這可能導(dǎo)致了其與有效氨基酸殘基的結(jié)合數(shù)量不高，所以抑制活性較DEEIDN 低[32]。最后是EQEEY，它是與XOD 作用最少的肽，與有效氨基酸殘基的結(jié)合有2 個(gè)，因此預(yù)測(cè)其活性較低，但是因?yàn)槠浞肿淤|(zhì)量大于DIDH，所以可能在進(jìn)入活性口袋的過程中易被阻隔[33]。根據(jù)上述結(jié)果，以別嘌呤醇與XOD 的氨基酸殘基結(jié)合為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)了篩選出的3 種肽與別嘌呤醇一致的結(jié)合位點(diǎn)，其中只有疏水相互作用沒有出現(xiàn)在篩選出的3 種肽中。

將篩選出的3 種肽與XOD 的已知活性抑制位點(diǎn)——黃嘌呤結(jié)合位點(diǎn)（對(duì)接中心為X：20.162026，Y：9.638915，Z：122.168331）進(jìn)行對(duì)接，只有四肽DIDH 可以與該位點(diǎn)結(jié)合。DIDH 與XOD 的氨基酸殘基 Phe649、Val1011、Ser876、Phe1099、Leu873、Ser1075、Phe1013 之間形成范德華力，與Glu802、Pro1076、Asn768 之間形成氫鍵，與Leu648、Leu1014 間形成疏水相互作用。黃嘌呤位點(diǎn)的對(duì)接可以證明DIDH 有可能是在這個(gè)位點(diǎn)與XOD 對(duì)接從而抑制XOD 活性，但是其它篩選出的肽卻無法通過該位點(diǎn)進(jìn)行直接對(duì)接，間接證明了FAD 位點(diǎn)成為XOD 抑制肽的篩選位點(diǎn)。與黃嘌呤結(jié)合位點(diǎn)相比，F(xiàn)AD 位點(diǎn)處可以與更多的氨基酸殘基相接觸，并且因?yàn)榭啥x的活性位點(diǎn)半徑遠(yuǎn)大于黃嘌呤結(jié)合位點(diǎn)，所以可以容納分子質(zhì)量較大的肽，這一點(diǎn)也說明了黃嘌呤位點(diǎn)只能與四肽DIDH 結(jié)合。

圖3 DIDH-XOD 黃嘌呤結(jié)合位點(diǎn)2D 模式圖Fig.3 2D pattern diagram of DIDH-XOD xanthine binding site

表4 XOD 氨基酸殘基結(jié)合對(duì)照表Table 4 Comparison table of XOD amino acid residue binding

2.2.3 活性驗(yàn)證結(jié)果 從生工生物工程（上海）股份有限公司合成了純度＞95%的DIDH、EQEEY、DEEIDN 以進(jìn)行最終的活性驗(yàn)證，首先用質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的3 種多肽驗(yàn)證其是否有XOD 抑制性，然后確定有抑制效果的多肽，并測(cè)定其半抑制濃度。

根據(jù)圖4b 可以確定黃嘌呤在該液相條件下在9.844 min 時(shí)出的峰，其峰面積為6 166 632，然后在相同的條件下檢測(cè)出加入50 μL XOD 后結(jié)果如圖4a 所示，黃嘌呤的峰面積減小為3 418 978，這說明在該反應(yīng)條件下XOD 具有良好的酶活能夠降解黃嘌呤。在此基礎(chǔ)上，分別向反應(yīng)體系中加入10 mg/mL 的3 種多肽，在反應(yīng)相同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)其具有良好的XOD 抑制活性，加入3 種多肽的反應(yīng)體系中，黃嘌呤并未明顯減少，其峰面積保持在6 048 187，5 959 283，6 030 867，與對(duì)照組黃嘌呤的含量差別不大，因此可以看出，3 種多肽具有良好的XOD 抑制活性。根據(jù)圖5可以直觀地看出3種肽中DEEIDN 擁有相對(duì)較好的XOD 抑制性，3種肽的抑制效果都非常明顯。該結(jié)果與上述的分子對(duì)接結(jié)果相一致。

圖4 黃嘌呤+XOD（a）、黃嘌呤（b）、黃嘌呤+XOD+DIDH（c）、黃嘌呤+XOD+EQEEY（d）、黃嘌呤+XOD+DEEIDN（e）液相示意圖Fig.4 High performance liquid phase diagram of xanthine+XOD （a），xanthine （b），xanthine +XOD+DIDH （c），xanthine +XOD+EQEEY （d），xanthine +XOD+DEEIDN （e）

圖5 黃嘌呤+XOD（a）、黃嘌呤（b）、黃嘌呤+XOD+DIDH（c）、黃嘌呤+XOD+EQEEY（d）、黃嘌呤+XOD+DEEIDN（e）活性驗(yàn)證效果統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Statistical results of activity verification of xanthine +XOD （a），xanthine （b），xanthine +XOD+DIDH （c），xanthine +XOD+EQEEY （d），xanthine+XOD+DEEIDN （e）

為了進(jìn)一步確認(rèn)3 種多肽的抑制活性，通過濃度梯度反應(yīng)以及SPSS 軟件確定其半抑制濃度[34]。

抑制率的計(jì)算公式為：

表5 DIDH、EQEEY、DEEIDN 的抑制率及半抑制濃度統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistical table of inhibitory rates and semi-inhibitory concentrations of DIDH，EQEEY，DEEIDN

在相同濃度下，3 種肽的抑制率及半抑制濃度都有不同的分布。從抑制率方面來看，DEEIDN的抑制率在濃度變化不大的情況下迅速發(fā)生變化，隨著濃度的變化幅度增大，其抑制率的增速反而下滑，這說明其半抑制濃度較小，根據(jù)SPSS 的統(tǒng)計(jì)分析其IC50=0.503 mg/mL，具有較強(qiáng)的XOD抑制活性，是3 種多肽中半抑制濃度最小的，并且DEEIDN 在相同的情況下，抑制率也是最高的，這與上述的分子對(duì)接結(jié)果相一致。DIDH 的抑制率是最低的，其半抑制濃度IC50=0.976 mg/mL，數(shù)據(jù)表明DIDH 對(duì)XOD 的抑制性是最低的，根據(jù)與XOD氨基酸殘基的結(jié)合情況來看，很有可能是因?yàn)榕cGly350 形成的范德華力的抑制效果大于與Ser347形成氫鍵的效果。在這種高劑量的情況下，可能會(huì)對(duì)人體造成未知的傷害，并且其工業(yè)化應(yīng)用的成本高，不宜產(chǎn)業(yè)化使用。EQEEY 在濃度較小的情況下，抑制率就已經(jīng)是三者中最高的，隨著濃度的增大，抑制率的升高速率逐漸減慢，導(dǎo)致了其半抑制濃度的增大，其半抑制濃度IC50=0.512 mg/mL。EQEEY 的抑制效果比DIDH 高，但又比EQEEY低，但其在低濃度的范圍下抑制率較高，可以將這一特性轉(zhuǎn)化為實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，在質(zhì)量濃度小于0.5 mg/mL 的使用情況下，這3 種肽中EQEEY最具競(jìng)爭(zhēng)力。

由于XOD 將黃嘌呤或次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子O2-從而導(dǎo)致對(duì)機(jī)體的氧化損傷，因此可以從超氧陰離子的產(chǎn)生效果間接來看小肽分子對(duì)XOD 的抑制性。

抗超氧陰離子自由基活力單位的公式：

3 種肽的抑制超氧陰離子的效果已經(jīng)統(tǒng)計(jì)出，在稀釋相同倍數(shù)的情況下，加入DEEIDN 后產(chǎn)生的抗超氧陰離子自由基單位最多。3 種多肽的抗自由基能力都低于標(biāo)準(zhǔn)品VC，但是對(duì)于空白組來說，可以減少超氧陰離子自由基對(duì)人體的損傷。3 種多肽的抗超氧陰離子自由基的能力 DEEIDN＞EQEEY＞DIDH，與上述3 種多肽的活性驗(yàn)證結(jié)果相一致，也與分子對(duì)接結(jié)果相一致。說明3 種多肽不僅對(duì)超氧陰離子自由基的產(chǎn)生有一定的抑制效果，而且對(duì)XOD 具有一定的抑制效果，成功篩選出了具有XOD 抑制性的活性肽。

表6 DIDH、EQEEY、DEEIDN 的超氧陰離子抑制效果Table 6 Inhibitory effect of DIDH，EQEEY，DEEIDN on superoxide anion

3 結(jié)論

本文通過線上虛擬酶解從鱸魚肌球蛋白中分離出了多肽，并且對(duì)符合分子對(duì)接要求的多肽進(jìn)行了ADMET 預(yù)測(cè)及分子對(duì)接打分，從中成功地篩選出對(duì)人體友好，且有抑制XOD 活性潛力的3種多肽。在對(duì)這3 種多肽進(jìn)行活性驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)了六肽DEEIDN 不僅具有良好的XOD 抑制率，半抑制濃度低于另外兩種肽，并且可以有效地清除超氧陰離子自由基，減少黃嘌呤氧化酶反應(yīng)過程中產(chǎn)生的活性氧對(duì)人體造成的氧化傷害，是一種有研究前景的XOD 抑制肽。

協(xié)同增效是功能性肽的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)[35-36]，因此，在篩選出XOD 抑制肽后，可以尋求其它有效成分與篩選出的多肽一起作用于XOD，使其抑制效果大于單一抑制劑對(duì)XOD 的抑制性是本試驗(yàn)下一步的目標(biāo)。