pH值對(duì)純化豬肉肌球蛋白熱聚集體的影響

婁愛華，潘 騰，陳 星，沈清武，張 炎，羅 潔，*

肌球蛋白是肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，也是肌肉中最重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的三分之一，是纖維狀蛋白質(zhì)的一種[1]。肌球蛋白整體形狀如豆芽狀，約160 nm 長，分子質(zhì)量約480 ku[2]，由兩條肌球蛋白重鏈（MHC，分子質(zhì)量220 ku）與4 條肌球蛋白輕鏈（LC，分子質(zhì)量17～22 ku）組成[3]。肌球蛋白是鹽溶性蛋白，其熱誘導(dǎo)凝膠特性影響肉制品的感官特性和質(zhì)構(gòu)特性等[4]。

肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的形成包括兩個(gè)階段，首先是肌球蛋白受熱變性，蛋白結(jié)構(gòu)打開，之后是肌球蛋白聚集進(jìn)而形成大的凝膠體，形成凝膠[5-6]。熱處理過程中，肌球蛋白聚集體的形成狀態(tài)影響最終蛋白凝膠體的結(jié)構(gòu)與功能特性。不同離子種類及pH 值條件下，肌球蛋白變性聚集速率不同，形成不同大小的聚集體。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，不同大小肌球蛋白聚集體在加熱過程中均可形成凝膠，然而，

小的蛋白聚集體形成粗糙的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，大的蛋白聚集體形成鏈狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，二者凝膠特性不同。溶液pH 值的改變會(huì)改變蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的電荷分布，同時(shí)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變決定蛋白質(zhì)內(nèi)部活性基團(tuán)的暴露程度，影響分子間的相互作用，最終影響蛋白質(zhì)聚集體的形成[9-10]。目前研究多集中于兔肉、雞肉以及魚肉中提取的肌球蛋白，針對(duì)pH 值對(duì)豬肉肌球蛋白的影響仍多為對(duì)蛋白凝膠形成特性的影響[11～13]。明確pH 值對(duì)豬肉肌球蛋白熱聚集過程中聚集體結(jié)構(gòu)改變的影響機(jī)制，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉肌球蛋白熱聚集行為的調(diào)控，從而達(dá)到良好的蛋白凝膠狀態(tài)。

本文通過制備豬肉肌球蛋白，利用濁度值與粒徑分布，研究在不同pH 值條件下肌球蛋白熱聚集體大小。同時(shí)通過肌球蛋白熱變性動(dòng)力學(xué)描述，評(píng)估肌球蛋白熱穩(wěn)定性的差異，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、肌球蛋白變性溫度、熱聚集體形態(tài)觀察進(jìn)行熱聚集體形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，旨在闡明豬肉肌球蛋白在不同pH 值下熱聚集形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬通脊肉：北京資源亞太食品有限公司，豬宰殺后立即取樣液氮冷凍，于-80 ℃凍藏備用。

蛋白Marker （#26630），美國Thermo 公司；ATP·Na2、Tris、EDTA、EGTA 等，均購于美國Amresco 公司；氯化鉀、焦磷酸鈉、氯化鎂、氯化鉀等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Prometheus NT.48 差示熒光掃描儀，美國Quantum Design 公司；HT7700 透射電子顯微鏡，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS 納米粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；顯微激光共聚焦拉曼光譜儀（LabRam HR800），法國 HORIBA JobinYvon 公司；UV-2102PC 紫外可見分光光度計(jì)，上海UNICO 公司；DELTA 320 酸度計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；酶標(biāo)儀（Tecan M200 PRO），瑞士Tecan 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 提取肌球蛋白 取剛宰殺后豬的通脊肉，剔除脂肪和結(jié)締組織，絞碎，用液氮速凍，之后放于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩＜∏虻鞍椎慕怆x純化參照Han 等[14]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。所有提取步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。取100 g 肉樣，放于5 倍體積溶液A （0.1 mol/L Tris-HCl pH=7，20 mmol/L EDTA）中勻漿10 min，離心（3 000 g，10 min）。取沉淀溶于3 倍體積“Hasselbach-Schneider”（H-S）[15]溶液（0.4 mol/L KCl，0.1 mol/L KH2PO4/K2HPO4，10 mmol/L Na4P2O7，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EGTA，pH 6.4） 中，勻漿20 min，離心 （5 000 g，10 min）。取上清，加入9 倍體積預(yù)冷超純水稀釋，過夜沉降。虹吸出上清部分，余下部分離心（12 000 g，12 min）。取沉淀，加入3 倍體積溶液B（0.1 mol/L KCl，pH 7.0），攪拌提取，離心（1 500 g，10 min）。取沉淀，加入溶液C （0.6 mol/L KCl，0.15 mol/L KH2PO4/K2HPO4，5 mmol/L Na4P2O7，5 mmol/L Mg Cl2，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L ATP·Na2，pH 6.5），攪拌提取30 min。

隨后，緩慢加入經(jīng)充分碾磨的硫酸銨固體使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到35%，離心（10 000 g，25 min），取上清；在上清中加入經(jīng)充分碾磨的硫酸銨固體使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到48%，繼續(xù)攪拌10 min，離心（10 000 g，25 min），取沉淀。所得沉淀即為肌球蛋白沉淀。

1.3.1.2 pH 值對(duì)肌球蛋白熱聚集行為影響的樣品制備 將所得肌球蛋白沉淀溶于0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 6.5）中，并以此緩沖液作為透析液透析24 h，中間透析液更換兩次。將透析所得蛋白溶液體積七等分（V/V），各組均加入氯化鈉使蛋白溶液中氯化鈉濃度均為0.6 mol/L，之后將各組pH 值分別調(diào)為5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，同時(shí)配置含有0.6 mol/L 氯化鈉濃度和相應(yīng)pH 值的0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液，將蛋白溶液中蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至20 mg/mL，放于0～4 ℃貯藏，1 周內(nèi)完成指標(biāo)測定。

1.3.2 SDS-PAGE 蛋白電泳 參照Laemmli[16]的方法，分離膠聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為12.5%，濃縮膠聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為4%。蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL，與5×上樣緩沖液4∶1 混合，沸水浴5 min，上樣量20 μL。初始電壓80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120 V。電泳結(jié)束，利用考馬斯亮藍(lán)R-250 進(jìn)行染色，醋酸-甲醇溶液進(jìn)行脫色。利用掃描儀掃膠，對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.3.3 濁度的測定 參考Xiong 等[17]的方法，將蛋白溶液稀釋到2 mg/mL，由20 ℃升溫至80 ℃，每10 ℃收集樣品1 次，以其320 nm 處的吸光值來表示蛋白質(zhì)溶液的濁度。每個(gè)樣品測定3 次平行，取平均值。

1.3.4 粒徑的測定[18]將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，由20 ℃升溫至80 ℃，每10 ℃收集樣品1次，放于1 cm 光程的石英比色皿中，散射角為173°。將樣品放入納米粒度分析儀，采用He-Ne激光在633 nm 波長條件下進(jìn)行測定，并用儀器自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品測定3 次平行，取平均值。

1.3.5 變性率的測定[19]將蛋白溶液稀釋到5 mg/mL，分別置于30，40，50，60，70，80 ℃條件下水浴加熱1，2，5，10，20，30 min，取出后迅速冰浴放于4 ℃貯藏。取熱處理后的樣品10 000 r/min 離心10 min，取上清，測定上清中蛋白濃度，每個(gè)樣品測定3 次平行，取平均值。肌球蛋白熱變性率計(jì)算公式如下：

變性率=（熱處理前溶液中蛋白質(zhì)量-熱處理后樣品上清中蛋白質(zhì)量）/熱處理前溶液中蛋白質(zhì)量×100%

1.3.6 蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析[20]利用差示熒光掃描儀進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的測定，將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，各組樣品10 μL 吸入毛細(xì)管進(jìn)行測定，溫度范圍20～80 ℃，升溫速率1 ℃/min，測定升溫過程中蛋白溶液F350nm/F330nm的變化，利用儀器自帶軟件分析蛋白升溫過程中變性溫度Tm。

1.3.7 Ca2+-ATP 酶活的測定 參照Benjakul 等[21]和Xu 等[22]的方法，略做修改。將蛋白溶液調(diào)至4 mg/mL，分別選取4，20，30，40，50，60，70 ℃進(jìn)行樣品收集，按照表1配制反應(yīng)混合液，配制時(shí)先將除ATP 以外的溶液加入混勻，將反應(yīng)混合液放于25℃水浴鍋中恒溫。之后加入ATP 溶液，立即開始計(jì)時(shí)。反應(yīng)進(jìn)行3 min，加入2 mL 15% TCA 終止反應(yīng)，之后10 000 g 離心2 min，取上清?？瞻捉M首先加入TCA，之后加入ATP。吸取4 mL 上清液，分別加入3 mL 0.05 mol/L Tris-馬來酸緩沖液（pH 7.0），振蕩混勻，之后加入3 mL 定磷試劑（20%VC，3 mmol/L H2SO4，3%鉬酸銨以等體積混合），放于45 ℃水浴鍋中恒溫30 min，取出冷卻，測定各組溶液640 nm 波長處吸光值。每個(gè)樣品測定3次平行，取平均值。

表1 反應(yīng)混合液的配制組成Table 1 Components of mixed reaction solution

Ca2+-ATP 酶活性表示為1 mg 酶蛋白在1 min 內(nèi)生成的無機(jī)磷酸量（μmol）。計(jì)算公式如下：

Ca2+-ATP 酶活性=0.0132 C 磷酸 μmol/mg/min

1.3.8 肌球蛋白聚集體的形態(tài)觀察[16]利用負(fù)染透射電鏡技術(shù)觀察蛋白聚集體形態(tài)。將蛋白溶液稀釋到0.5 mg/mL，用于負(fù)染透射電鏡的樣品制備。吸取5 μL 熱處理后蛋白樣品滴于鍍碳膜銅網(wǎng)，靜置1 min，之后超純水沖洗3 次，濾紙吸干。吸取3.5 μL 醋酸鈾染液滴于銅網(wǎng)，預(yù)染兩次，濾紙吸干，之后染色45 s，濾紙吸干，烘干后可用于透射電鏡觀察（加速電壓：80 kV）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析均采用版本為17.0 的SPSS 軟件進(jìn)行（SPSS In.，Chicago，IL）。各組間的數(shù)值用ANOVA 和Duncan 多重比較分析，當(dāng)P<0.05 認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜觀察

通過硫酸銨分級(jí)沉淀的方法對(duì)粗肌球蛋白溶液進(jìn)一步純化，以去除溶液中所含的肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白等其它鹽溶蛋白，純化后肌球蛋白SDSPAGE 電泳圖譜如圖1所示。由圖可知，粗肌球蛋白經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀后純度得到提高。在電泳過程中，肌球蛋白變性被分解為4 種亞基，分別為肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈3，實(shí)現(xiàn)肌球蛋白充分解離的效果。

圖1 純化后所得的肌球蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE of myosin after purification

2.2 肌球蛋白熱聚集過程中濁度的改變

pH 值對(duì)肌球蛋白加熱過程中濁度的影響如圖2所示。在20 ℃時(shí)，pH 值并未對(duì)肌球蛋白濁度值產(chǎn)生顯著影響（P>0.05）。但是隨著溫度升高，各處理組間差異逐漸顯著。其中，pH 5.5 處理組中肌球蛋白濁度值在40 ℃時(shí)即出現(xiàn)顯著升高（P<0.05）。pH 6 和6.5 處理組中肌球蛋白濁度值在50 ℃出現(xiàn)顯著升高（P<0.05），pH 7 處理組中肌球蛋白濁度值在70 ℃出現(xiàn)顯著升高。但是pH 7.5，8和8.5 處理組中肌球蛋白濁度在升溫過程中未發(fā)生顯著升高現(xiàn)象，此3 個(gè)處理組肌球蛋白濁度值隨著溫度升高均呈緩慢上升趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，pH 5.5，6 和6.5 處理組中肌球蛋白濁度值顯著高于其它處理組（P<0.05），3 組之間無顯著差異（P>0.05）。pH 7.5，8 和8.5 處理組中肌球蛋白濁度在80 ℃時(shí)，顯著低于其它處理組（P<0.05），3 組間無顯著差異（P>0.05）。

圖2 不同pH 值條件下肌球蛋白加熱過程中濁度的改變Fig.2 Effects of pH on turbility of porcine myosin during heating

2.3 肌球蛋白聚集體的粒度表征

pH 值對(duì)肌球蛋白加熱過程中粒徑的影響如圖3所示。研究發(fā)現(xiàn)，初始溫度時(shí)，pH 5.5 處理組粒徑值高于其它處理組，但未出現(xiàn)顯著差異（P>0.05）。隨著溫度升高，各處理組粒徑值均逐步升高，其中pH 5.5，6 和6.5 處理組平均粒徑在溫度40～60 ℃時(shí)升高顯著，pH 7，7.5，8 和8.5 處理組平均粒徑則在溫度50～60 ℃時(shí)升高顯著 （P<0.05）。當(dāng)溫度70～80 ℃時(shí)，pH 8 和8.5 處理組平均粒徑無顯著變化，平均粒徑為730～760 nm，顯著低于其它處理組（P<0.05）；其它處理組仍逐步升高，其中pH 6.5，7 和7.5 處理組平均粒徑為940～1 000 nm，pH 5.5 和6 處理組平均粒徑為1 200～1 300 nm，顯著高于其它處理組（P<0.05）。

圖3 不同pH 值條件下肌球蛋白加熱過程中粒徑的改變Fig.3 Effects of pH on particle size of porcine myosin during heating

2.4 肌球蛋白熱變性率分析

分別選取pH 5.5 和pH 8.5 處理組進(jìn)行肌球蛋白熱變性動(dòng)力學(xué)分析。

pH 值對(duì)肌球蛋白加熱過程中變形率的影響如圖4所示。pH 5.5 條件下，不同溫度處理組隨著加熱時(shí)間的延長，肌球蛋白變性率逐漸升高。其中，80 ℃條件下，加熱時(shí)間達(dá)到2 min，肌球蛋白變性率即達(dá)到80%，蛋白變性率升高速率高于pH 6.5 處理組。加熱溫度70 ℃和80 ℃條件下，加熱時(shí)間達(dá)到20 min，肌球蛋白變性率均接近100%。加熱溫度30 ℃和40 ℃處理組，當(dāng)加熱時(shí)間達(dá)到10 min 后，蛋白變性率升高速率高于pH 6.5 處理組。pH 8.5 條件下，加熱溫度70 ℃與80 ℃條件下，加熱時(shí)間達(dá)到30 min，肌球蛋白變性率才升至90%以上。加熱溫度60 ℃條件下，加熱時(shí)間達(dá)到30 min，肌球蛋白變性率為48.12%，顯著低于其它pH 值處理組（P<0.05）。pH 8.5 條件下，肌球蛋白變性率升高速率顯著低于pH 5.5 與pH 6.5 處理組（P<0.05）。因此，隨著pH 值的升高，肌球蛋白變性速率逐漸降低。

圖4 不同pH 值下熱處理對(duì)肌球蛋白變性率的影響Fig.4 Effects of heat treatment on denaturation rate of porcine myosin with different pH values

2.5 肌球蛋白熱聚集過程中蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析

從圖5和表2可知，隨著pH 值的升高，肌球蛋白變性溫度Tm1與Tm2均呈升高趨勢。其中，當(dāng)?shù)鞍兹芤簆H 值由5.5 升至8.5 時(shí)，Tm1由39.2 ℃升至44.9 ℃，當(dāng)?shù)鞍兹芤簆H 值由5.5 升至8.5時(shí)，Tm2由52.2 ℃升至54.9 ℃，Tm2變化程度低于Tm1。由此說明，pH 值的升高延緩了肌球蛋白兩個(gè)結(jié)構(gòu)域解折疊行為的發(fā)生，肌球蛋白的結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性得到提高，但是，pH 7.5，8 以及8.5 3 個(gè)處理組之間，肌球蛋白變性溫度Tm1與Tm2無顯著差異，說明pH 值進(jìn)一步提高對(duì)肌球蛋白結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性無顯著影響。

圖5 不同pH 值條件下肌球蛋白熒光曲線圖（a）及其一階導(dǎo)數(shù)圖（b）Fig.5 Differential scanning fluorimetr （DSF） curve of porcine myosin （a） and the first derivative of the DSF curve （b） at different pH values

表2 pH 值對(duì)肌球蛋白變性溫度Tm 的影響Table 2 Effects of pH on the thermal denaturation temperature of porcine myosin

2.6 肌球蛋白熱聚集過程中Ca2+-ATP 酶活的變化

Ca2+-ATP 酶活性位點(diǎn)位于肌球蛋白頭部，主要用來判斷肌球蛋白聚集過程中頭部結(jié)構(gòu)完整性及頭部參與蛋白聚集行為的程度[23-25]。如圖6所示，pH 5.5 條件下，肌球蛋白Ca2+-ATP 酶活性顯著低于其它處理組，由于pH 5.5 接近肌球蛋白等電點(diǎn)，在處理過程中容易引起肌球蛋白的變性，當(dāng)加熱溫度到達(dá)40 ℃時(shí)，Ca2+-ATP 酶活性降為0，因此，肌球蛋白Ca2+-ATP 酶活性最低。初始溫度4 ℃時(shí)，隨著pH 值的升高，Ca2+-ATP 酶活性逐漸降低，pH 8.5 時(shí)Ca2+-ATP 酶低于其它處理組。隨著加熱溫度的升高，Ca2+-ATP 酶活性逐漸降低，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，pH 6 和6.5 處理組Ca2+-ATP酶活性降為0，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，pH 7，7.5，8和8.5 處理組Ca2+-ATP 酶活性降為0。其中，溫度30～40 ℃時(shí)，pH 6 和6.5 處理組Ca2+-ATP 酶活性下降速率高于pH 8 和8.5 處理組。因此，隨著pH值的升高，Ca2+-ATP 酶失活速率逐漸降低，失活溫度逐漸提高，說明蛋白溶液pH 值的升高導(dǎo)致肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)解折疊行為發(fā)生緩慢，分子間聚集速率降低。

圖6 pH 值對(duì)肌球蛋白熱變性的Ca2+-ATP 酶活性影響Fig.6 Effects of pH on Ca2+-ATPase activity of porcine myosin during heating

2.7 肌球蛋白聚集體的形態(tài)觀察

根據(jù)不同處理組間蛋白粒徑及蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的差異，選取具有代表性的pH 值5.5，8.5，分別在20，50，80 ℃3 個(gè)處理溫度條件下，對(duì)蛋白聚集體的形態(tài)進(jìn)行觀察。

圖7 不同pH 值條件下熱處理過程中肌球蛋白的透射電鏡圖（×200 000）Fig.7 Transmission electron microscope of myosin with different pH values during heating

從上圖可知，在同一pH 值條件下，隨著溫度的升高，蛋白逐漸聚集。pH 5.5 處理組中，在20℃時(shí)，肌球蛋白分散于鹽溶液中，蛋白之間未發(fā)生聚集現(xiàn)象，溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，蛋白互相聚集，形成小的聚集體，但是對(duì)比發(fā)現(xiàn)，聚集體周圍無明顯向外散射的肌球蛋白尾部，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，蛋白進(jìn)一步聚集，但是聚集體結(jié)構(gòu)較松散，呈顆粒狀聚集狀態(tài)。pH 8.5 處理組中，在20 ℃時(shí)，肌球蛋白分散于鹽溶液中，蛋白之間未發(fā)生聚集現(xiàn)象，與pH 5.5 處理組無顯著差異，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，蛋白互相聚集，部分聚集體之間通過肌球蛋白尾部互相連結(jié)，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，蛋白進(jìn)一步聚集，聚集體之間蛋白尾部結(jié)合明顯，蛋白之間聚集充分。

3 結(jié)論

本文研究了不同pH 值對(duì)肌球蛋白熱聚集行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，pH 值由5.5 升高至8.5，蛋白變性溫度由40.2 ℃降至36.9 ℃，Ca2+-ATP 酶失活溫度由40 ℃升至60 ℃，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蛋白聚集體之間交聯(lián)程度顯著增加。此外，pH 5.5 的條件下，由于接近蛋白等電點(diǎn)，肌球蛋白在初始溫度下即容易互相碰撞聚集，但是由于蛋白結(jié)構(gòu)未充分展開，分子間疏水性相互作用較弱，蛋白雖然快速聚集在一起，但是聚集體結(jié)構(gòu)較為松散，形成顆粒狀聚集體。隨著pH 值的升高，由于蛋白之間靜電斥力的作用，使得蛋白聚集速率降低，加熱過程中蛋白變性，結(jié)構(gòu)充分展開，疏水基團(tuán)暴露度高，分子間疏水性相互作用強(qiáng)烈，分子之間有序聚集。本研究闡明了豬肉肌球蛋白熱聚集形成機(jī)制，為解析其它纖維狀蛋白質(zhì)聚集機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)指導(dǎo)肉制品工業(yè)生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。