基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討澳洲茄堿抗腫瘤機(jī)制

高聚偉 徐 凱 冉 冉

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年新發(fā)惡性腫瘤1808 萬(wàn)例，死亡956 萬(wàn)例，而中國(guó)分別占新發(fā)的23.7%和死亡的30%[1]。中醫(yī)辨治腫瘤經(jīng)驗(yàn)豐富，是我國(guó)腫瘤治療重要組成部分。中藥通過多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)抗腫瘤，在腫瘤防治中應(yīng)用廣泛。澳洲茄堿（solasonine，SS）是傳統(tǒng)抗癌中藥龍葵（Solanum nigrum L.）的主要抗癌成分，研究表明，澳洲茄堿通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期等機(jī)制，在膀胱癌、肝癌、胃癌等多種癌腫中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[2-5]。澳洲茄堿抗腫瘤作用靶點(diǎn)及機(jī)制目前未完全明確。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)澳洲茄堿抗腫瘤作用靶點(diǎn)及機(jī)制進(jìn)行研究，為澳洲茄堿進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床使用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 澳洲茄堿藥物靶點(diǎn)篩選 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）獲得澳洲茄堿mol2 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），取Norm Fit 預(yù)測(cè)得分大于0，經(jīng)uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)名稱矯正統(tǒng)一，篩選出澳洲茄堿潛在靶點(diǎn)。

1.2 腫瘤疾病靶點(diǎn)篩選 以“cancer”為關(guān)鍵詞，使用OMIM（https://omim.org/）、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）檢索，獲得疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)篩選及“疾病-靶點(diǎn)-成分”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上輸入澳洲茄堿潛在靶點(diǎn)及腫瘤疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，兩者交集即為澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)。將澳洲茄堿潛在靶點(diǎn)和澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.7.2軟件中，繪制“疾病-靶點(diǎn)-成分”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 澳洲茄堿-腫瘤蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及基于聚類分析的核心靶點(diǎn)篩選 將澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）中檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，將獲取的靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI 網(wǎng)絡(luò)）。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap3.7.2，使用MCODE 模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.5 澳洲茄堿-腫瘤基因功能及通路富集分析 基于R3.6.0 軟件用Bioconductor 生物信息軟件包，以P<0.05、Q<0.05 進(jìn)行關(guān)鍵靶基因GO 功能與KEGG通路富集分析，對(duì)澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能及主要信號(hào)通路分析，將結(jié)果以條形圖或氣泡圖形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄堿潛在抗腫瘤作用靶點(diǎn)信息 共獲得289 個(gè)澳洲茄堿潛在靶點(diǎn)，1186 個(gè)腫瘤靶點(diǎn)，韋恩圖中兩者取交集后獲得79 個(gè)澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)（見圖1）。將此79 個(gè)共同靶點(diǎn)和澳洲茄堿潛在靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.7.2 軟件中，繪制出“疾病-靶點(diǎn)-成分”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，圖中紅色代表疾病，紫色代表澳洲茄堿，藍(lán)色代表79 個(gè)共同靶點(diǎn)（見圖2）。

圖1 澳茄堿洲-腫瘤靶點(diǎn)基因匹配情況

圖2 澳洲茄堿與腫瘤作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 PPI 分析結(jié)果及澳洲茄堿抗腫瘤核心靶點(diǎn)信息PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3，共有79 個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶基因）通過968條邊發(fā)揮作用。節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，澳洲茄堿抗腫瘤的各個(gè)靶點(diǎn)之間聯(lián)系緊密。進(jìn)一步聚類分析篩選得到3個(gè)基因簇和3 個(gè)核心基因：IGF1R、MAP2K1、CHEK1，見圖4。

圖3 PPI 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI 核心基因簇

2.3 GO 功能富集分析 將79 個(gè)澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語(yǔ)言運(yùn)行后進(jìn)行GO 分析，包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和 分 子 功 能（molecular function，MF）。GO 結(jié)果顯示，共富集至1559 條生物學(xué)過程、33 條細(xì)胞組成過程和116 條分子功能過程中。根據(jù)P 值，將前10 個(gè)條目進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理形成條形圖（見圖5）。結(jié)果表明，澳洲茄堿可能通過參與調(diào)控多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的生物學(xué)過程來發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5 澳洲茄堿-腫瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過程富集分析

2.4 KEGG 富集分析 對(duì)79 個(gè)澳洲茄堿-腫瘤共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語(yǔ)言運(yùn)行后進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到136 條KEGG 通路，包括前列腺癌、大腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞白血病、膀胱癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等通路，涉及PI3KAkt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等經(jīng)典信號(hào)通路。排名前20 的有蛋白聚糖、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、乙型肝炎、雌激素信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、松弛素信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、大腸癌、催乳素信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌、粘附連接、乳腺癌、Rap1 信號(hào)通路、胃癌、慢性粒細(xì)胞白血病、膀胱癌通路。由此推測(cè)，澳洲茄堿可能通過調(diào)節(jié)以上信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。根據(jù)P 值，將排名前20 的結(jié)果形成KEGG 功能富集的氣泡圖（見圖6）。通過通路基因參與數(shù)、P 值及富集因子分析，前9 通路相關(guān)基因靶點(diǎn)見表1。

圖6 澳洲茄堿-腫瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析

表1 澳洲茄堿-腫瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集靶點(diǎn)

3 討論

中藥的活性化合物是藥物最佳來源之一，但人們對(duì)其作用靶點(diǎn)和機(jī)制了解不深[6]，采用計(jì)算方法重新定位受體中的藥物分子正成為藥物研發(fā)主流[7]。中藥龍葵對(duì)多種腫瘤均有顯著抗癌療效[8]，澳洲茄堿為主要活性成分，但其具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制并未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為分析中藥作用機(jī)制的新興學(xué)科，包含網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為闡明中藥現(xiàn)代藥理機(jī)制提供了新方法[9]。

本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)澳洲茄堿抗腫瘤潛在作用靶點(diǎn)及通路進(jìn)行了較系統(tǒng)分析。結(jié)果共篩選出79 個(gè)抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)，其中3 個(gè)核心基因?yàn)镮GF1R、MAP2K1 和CHEK1。IGF1R 調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[10]，刺激細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[11]。MAP2K1 則參與增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育等許多細(xì)胞過程[12]。CHEK1 介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、應(yīng)對(duì)DNA 損傷，是癌癥治療潛在靶點(diǎn)[13]。在澳洲茄堿抗腫瘤信號(hào)通路中，PI3K-Akt、MAPK 及Ras 與腫瘤發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。PI3K-Akt參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝等過程[14]。Ras/MAPK 是胞內(nèi)傳導(dǎo)主要途徑，在胚胎生長(zhǎng)、細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Ras 和PI3K 與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)，通過調(diào)控下游mTOR 在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ras-PI3K 及其激活的mTOR 信號(hào)通路涉及多個(gè)癌基因與抑癌基因的激活和失活，是當(dāng)下腫瘤研究熱點(diǎn)[15]。由此可見，澳洲茄堿抗腫瘤的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制與上述3 個(gè)核心基因和PI3K-Akt、MAPK 及Ras 等信號(hào)通路關(guān)系密切。

綜上所述，澳洲茄堿參與多個(gè)生物學(xué)過程和信號(hào)通路，抗腫瘤核心靶點(diǎn)為IGF1R、MAP2K1 和CHEK1，核心信號(hào)通路為PI3K-Akt、MAPK 及Ras，提示澳洲茄堿具“多靶點(diǎn)-多通路”作用機(jī)制。