草魚養(yǎng)殖模式對氣單胞菌屬細菌群落影響分析

徐先棟，付輝云，歐陽敏，萬國湲，饒 毅，黃江峰，周智勇，劉禮輝

( 1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380； 2.江西省水產(chǎn)科學研究所，江西 南昌 330039； 3.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西 南昌 330052 )

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖主養(yǎng)品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量多年來約占據(jù)全國淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量的1/5[1]，為我國水產(chǎn)品市場提供了價格實惠、質(zhì)量優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源。經(jīng)過多年的養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展，目前草魚養(yǎng)殖形成了以池塘精養(yǎng)為主，山塘養(yǎng)殖、魚菜共生養(yǎng)殖等為補充的多種養(yǎng)殖模式。池塘精養(yǎng)和魚菜共生模式全程投喂配合飼料，山塘養(yǎng)殖主要投喂草料，或少量搭配配合飼料。研究者對不同養(yǎng)殖模式下草魚品質(zhì)和生理功能等方面開展了研究，如張愛芳等[2]研究了此3種模式下草魚的營養(yǎng)成分和氨基酸的組成，雷曉中等[3]研究了3種模式下草魚肝胰臟結(jié)構(gòu)與功能的變化。此類研究以草魚本身為對象，研究不同養(yǎng)殖模式對草魚自身指標的影響，為草魚健康養(yǎng)殖提供了部分理論依據(jù)。不過，鮮見有不同養(yǎng)殖模式對草魚養(yǎng)殖環(huán)境(水體和底泥)系統(tǒng)，特別是對細菌群落影響的對比研究，常見單個養(yǎng)殖模式對水體或底泥細菌群落的研究，如馬富平[4]研究了草魚精養(yǎng)模式池塘微生物群落結(jié)構(gòu)，程瑩寅等[5]研究了草魚精養(yǎng)池塘底泥微生物群落多樣性，何濤[6]研究了草魚精養(yǎng)池塘水體的細菌群落結(jié)構(gòu)。目前僅見其中2個模式的菌群差異的研究，如Qin等[7]研究了草魚精養(yǎng)和草飼池塘細菌多態(tài)性。細菌是養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，充當著分解者角色，關(guān)系到整個養(yǎng)殖環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。研究草魚養(yǎng)殖系統(tǒng)環(huán)境中的細菌群落，特別是病原菌的分布及其多樣性，對于養(yǎng)殖病害的防治具有重要的理論和現(xiàn)實意義。為此筆者研究草魚不同養(yǎng)殖模式下氣單胞菌屬細菌菌群結(jié)構(gòu)與分布，為豐富草魚健康養(yǎng)殖理論提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 草魚養(yǎng)殖模式

草魚3種養(yǎng)殖模式分別為：草魚池塘精養(yǎng)模式，產(chǎn)量約15 000 kg/hm2，投喂配合飼料；草魚山塘養(yǎng)殖，產(chǎn)量約4500 kg/hm2，投喂黑麥草等草料；草魚魚菜共生養(yǎng)殖，產(chǎn)量約15 000 kg/hm2，投喂配合飼料，種植10%水空心菜(Ipomoeaaquatica)。采集池塘水樣和底泥，采樣時間為2017年5—7月(養(yǎng)殖投喂旺盛期)，每種養(yǎng)殖模式選取2口池塘，在池塘兩端和中部各設(shè)置1個采樣點。

1.2 池塘水體細菌采集

用采水器在池塘兩端和中部采集表層15 cm處水樣，現(xiàn)場混勻后，裝入滅菌塑料瓶中，低溫保存，4 h內(nèi)送實驗室檢測。采用RS培養(yǎng)基平板涂布法，分別取0.1 mL水樣和經(jīng)10倍和100倍稀釋的樣品涂布，28 ℃培養(yǎng)24 h后，取菌落數(shù)為30～100個的平板，根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取不同形態(tài)單菌落純化培養(yǎng)，每種形態(tài)菌落至少挑取2～3個，經(jīng)鑒定為同一種菌則記錄為1株菌。純化后的菌株以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h，加終體積分數(shù)為15%無菌甘油，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 底泥細菌采集

在池塘兩端和中部用采泥器采集表層底泥，現(xiàn)場各無菌稱取5 g底泥，置于裝有135 mL的無菌生理鹽水的塑料瓶中，振蕩混勻，放置采樣箱低溫保存，4 h內(nèi)帶回實驗室進行細菌分離。底泥混懸液靜置后，吸取上清液0.1 mL涂布于RS培養(yǎng)基平板上。28 ℃培養(yǎng)24 h后進行細菌分離。細菌分離方法同1.2。

1.4 細菌鑒定

采用16S rDNA序列測序方法鑒定細菌。序列經(jīng)16S rDNA通用引物27F/1492R PCR擴增，產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。序列上傳至GenBank網(wǎng)站比對，進行細菌鑒定。對氣單胞菌屬細菌，進一步結(jié)合可變區(qū)特征序列鑒定到種[8]，如維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的16S rDNA第1可變區(qū)特征性的序列TACTGGAAACGGTA，第2可變區(qū)特征性的序列TGGTAGCTAATAACTGCCAG。數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007軟件進行。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離

試驗共分離54株細菌。其中精養(yǎng)池塘分離13株，底泥分離細菌少，且菌落形態(tài)單一，經(jīng)隨機挑取3個菌落，鑒定同為維氏氣單胞菌，記錄為1株菌，水體12株；山塘養(yǎng)殖池塘分離20株，底泥9株，水體11株；魚菜共生池塘分離21株，底泥8株，水體13株(表1)。

表1 養(yǎng)殖水體和底泥分離細菌信息

細菌經(jīng)16S rDNA測序鑒定分析，共分為10屬22種，其中氣單胞菌屬細菌占優(yōu)勢，為23株，其后為假單胞菌屬細菌8株、檸檬酸桿菌屬6株、腸桿菌屬7株、泛菌屬及沙雷氏菌屬各3株，其他果膠桿菌屬、沙門氏菌屬、克呂沃爾菌屬、勒克菌屬各1株(圖1)。按種類分，維氏氣單胞菌最多，為12株，嗜水氣單胞菌次之，為10株。煙粉腸桿菌6株，弗氏檸檬酸桿菌5株，其他菌1～2株不等(表1，圖1)。

圖1 分離細菌種屬分布Fig.1 The genera of isolated bacteria

2.2 細菌種類分析

按養(yǎng)殖模式來源分：魚菜共生養(yǎng)殖池塘分離細菌種類最多，為13種21株菌，分離的嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌占比較少，分別為3株和4株；假單胞菌屬細菌4株；山塘養(yǎng)殖環(huán)境中共分離到12種20株菌，其中嗜水氣單胞菌占多數(shù)，為7株，維氏氣單胞菌3株次之；精養(yǎng)池塘中分離細菌種類最少，只分離到5種菌，13株，其中維氏氣單胞菌和檸檬酸桿菌屬占優(yōu)勢，各為5株(圖2)。

按細菌環(huán)境來源分：底泥中共分離15株菌，分屬5種，以氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬細菌為主，其中嗜水氣單胞菌占絕大多數(shù)，為9株，其他細菌如弗氏檸檬酸菌為4株，豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌以及煙粉腸桿菌各1株。水體中共分離39株菌，分屬21種，優(yōu)勢種屬為氣單胞菌屬、假單胞菌屬及腸桿菌屬細菌，分別為12株和5株，其中維氏氣單胞菌分布最多，為11株，其他種屬細菌，如泛菌屬、果膠桿菌屬細菌等1～2株不等(圖3)。

圖2 不同養(yǎng)殖模式分離細菌統(tǒng)計Fig.2 The statistics of bacteria isolated from different culture modes

圖3 底泥和水體分離細菌種類分布Fig.3 The bacterial distribution in sediment and water

3 討 論

3.1 RS培養(yǎng)基平板分離細菌分析

RS培養(yǎng)基是20世紀70年代初期研制的最早是用于嗜水氣單胞菌的選擇性培養(yǎng)基，根據(jù)嗜水氣單胞菌發(fā)酵麥芽糖產(chǎn)生黃色菌落而鑒別[9]。氣單胞菌屬細菌是淡水養(yǎng)殖主要病原菌，本試驗主要是研究草魚不同養(yǎng)殖模式環(huán)境中的氣單胞菌屬細菌分布情況，為草魚在不同養(yǎng)殖模式下健康養(yǎng)殖提供理論參考，故采用RS培養(yǎng)基進行細菌的分離。在RS培養(yǎng)基上，根據(jù)細菌的不同生化特性，還會產(chǎn)生3種不同菌落形態(tài)，如黃色菌落中心現(xiàn)黑點，該類細菌具有發(fā)酵麥芽糖并產(chǎn)生H2S，包括變形桿菌屬(Proteus)、檸檬酸桿菌屬細菌等；黃綠色菌落，顯示賴氨酸或(和)鳥氨酸脫羧，包括沙門氏菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬細菌等；綠色菌落中心現(xiàn)黑色表示的是賴氨酸或(和)鳥氨酸脫羧，并且產(chǎn)生H2S，該類細菌有檸檬酸桿菌屬、沙門氏菌屬、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)等。20世紀70年代初期，氣單胞菌屬中許多細菌還未有分離報道，現(xiàn)在隨著細菌分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)許多氣單胞菌屬細菌表現(xiàn)不同的生理生化特性，如維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌(A.sobria)具有賴氨酸脫羧特征，殺鮭氣單胞菌(A.salmonida)產(chǎn)生H2S等[10]，從而使RS培養(yǎng)基在鑒定氣單胞菌屬細菌顯示了多種形態(tài)。為研究細菌分布多態(tài)性，將可以在RS培養(yǎng)基上生長的細菌進一步分離純化鑒定，從而使鑒定的種類出現(xiàn)了假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬細菌等。

3.2 不同養(yǎng)殖模式下細菌分布情況分析

從不同養(yǎng)殖模式細菌種類上可以看出，魚菜共生養(yǎng)殖環(huán)境中細菌分離種類最多，暗示細菌多態(tài)性可能也最高，細菌多態(tài)性高的池塘，水質(zhì)更好，最不易發(fā)病[11-12]。如孫蘇燕等[13]研究了健康和患病三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)養(yǎng)殖池塘表層底泥細菌群落的變化，結(jié)果表明，病害塘中變形菌門細菌無論是多樣性還是豐度均有所降低。山塘養(yǎng)殖池塘分離細菌種類也較多，不過因其產(chǎn)量低，效益不高，所以代表性不強。與已有的研究結(jié)果[14]相似，本試驗中精養(yǎng)池塘細菌種類較少，潛在致病菌如維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等含量多。分析原因可能是[14]：一方面沉積在底層的殘餌、糞便等有機物超出了環(huán)境自凈能力，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)向微生物輸入，未被充分氧化分解的殘餌、糞便產(chǎn)生有害物質(zhì)，也阻礙了微生物生長；另一方面，隨著配合飼料等的持續(xù)性加入，對菌群進行了定向性馴化，從而導(dǎo)致了菌群種類的降低。因而，精養(yǎng)池塘養(yǎng)殖魚類更易發(fā)生病害，魚肉品質(zhì)也稍有下降[2]。相比而言，魚菜共生系統(tǒng)，綜合了水產(chǎn)養(yǎng)殖和水栽培技術(shù)，在凈化水質(zhì)和促進物質(zhì)轉(zhuǎn)移方面具有顯著作用，可產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品和新鮮蔬菜，獲得雙重效益，值得大力推廣。

3.3 水體和底泥細菌分布特征

試驗分離的氣單胞菌屬細菌，如維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌分布具有明顯的環(huán)境差異。水體中以維氏氣單胞菌為主，12株維氏氣單胞菌中11株分離自水體，占比為91.6%；底泥中以嗜水氣單胞菌為主，本試驗10株嗜水氣單胞菌中有9株分離自底泥，占總數(shù)的90%。結(jié)果與已有的研究相似，如楊五名[15]研究淡水池塘中氣單胞菌的生態(tài)學與流行病學，結(jié)果也顯示，嗜水氣單胞菌在淡水養(yǎng)殖水體中的分布并不廣泛，豐度也不高。維氏氣單胞菌是在水體中分布最廣泛、豐度也較高的氣單胞菌種類。諸多研究均表明，維氏氣單胞菌是近年來淡水養(yǎng)殖主要病原菌[16-18]。維氏氣單胞菌是條件致病菌，在水體中分布廣泛，與魚體直接接觸，當魚體因捕撈生產(chǎn)操作受傷，或環(huán)境變化，引起的免疫力低下等因素，易患維氏氣單胞菌病，可能正是近年來該病流行的原因。已有研究表明，底泥是魚類細菌病的病原庫[5]，本試驗中分離的嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌屬細菌[19]等致病菌大都存在于精養(yǎng)池塘的底泥中，也證明了這一點。致病菌和環(huán)境中其他微生物處于一種動態(tài)平衡之中，彼此競爭，如果養(yǎng)殖環(huán)境惡化時，微生物群落結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，許多條件致病菌就會大量繁殖，養(yǎng)殖動物就很容易患病。研究結(jié)果提示，要做好維氏氣單胞菌的防控工作，同時要維護好整個養(yǎng)殖系統(tǒng)環(huán)境穩(wěn)定，使嗜水氣單胞菌不能在底泥中釋放，以降低草魚疾病發(fā)生風險。

4 結(jié) 論

草魚池塘精養(yǎng)殖、山塘草飼養(yǎng)殖和魚菜共生養(yǎng)殖3種養(yǎng)殖模式中底泥和水體的氣單胞菌屬細菌分布研究表明：魚菜共生養(yǎng)殖模式，水體和底泥中細菌種類多，潛在致病菌數(shù)量少，與前兩種模式相比，草魚魚菜共生養(yǎng)殖模式在降低疾病暴發(fā)風險和提高養(yǎng)殖綜合效益上具有優(yōu)勢。