• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    日本無針烏賊胚胎期眼部發(fā)育相關(guān)基因的研究

    2021-07-21 09:28:40李少剛李永芹許樂樂陳道海王鋰韞
    水產(chǎn)科學(xué) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:形成期無針原基

    李少剛,李永芹,2,許樂樂,2,陳道海,2,王鋰韞,2,3

    ( 1.嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江 524048; 2.廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江 524048; 3.廣東省特殊兒童發(fā)展與教育重點實驗室,廣東 湛江 524048 )

    日本無針烏賊(Sepiellajaponica)屬軟體動物門、頭足綱、十腕目、烏賊科、無針烏賊屬,因其高度進化、發(fā)展并集中的神經(jīng)系統(tǒng),被認為是研究眼睛形態(tài)發(fā)育的模式生物[1]。在胚胎發(fā)育過程中,有關(guān)頭足類動物光敏度的研究表明,在孵化前,胚胎在視網(wǎng)膜最終分化之前會變得光敏[2-3]。與其他頭足類動物不同,烏賊卵周圍有黑色的包膜,從而減弱了進入胚胎的光線,烏賊胚胎會在黑暗的視覺環(huán)境中發(fā)育,當(dāng)眼部器官分化到第一個視網(wǎng)膜色素出現(xiàn)的時期,烏賊胚胎對光照做出反應(yīng)[4-8]。目前針對日本無針烏賊胚胎期眼部發(fā)育的研究多集中于外源性因素,如光照、飼料、藥物等,而關(guān)于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機制對日本無針烏賊胚胎期眼部分化的影響卻鮮有報道。

    多細胞生物視覺結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生受到一個保守的基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控[9]。在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中,paired-box 6(pax6)是高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族paired-box的成員之一[10-11],也被認為是控制眼睛形態(tài)發(fā)生的通用基因,有研究表明,其在多細胞生物眼睛光敏感受器的發(fā)育過程起到重要作用[12-13]。除pax6之外,SIX Homeonox 3 (six3)、Eyes Absent (eya)基因也參與了多細胞生物視細胞的增殖、視網(wǎng)膜前體的分化、光敏感受器神經(jīng)元的分化和維持,以及其他非視網(wǎng)膜組織和器官的發(fā)育過程[14-17]。筆者在日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組測序分析的水平[18]上進一步探討與日本無針烏賊胚胎眼部發(fā)育過程相關(guān)調(diào)控基因six3、eya及pax6的表達變化。

    不同研究者對烏賊胚胎發(fā)育的分期各有不同,劉振勇等[19]將烏賊受精卵到出膜幼體分為22期;蔣霞敏等[20]從胚胎的受精卵階段至孵化階段將烏賊卵的發(fā)育過程分為12個階段;von Boletzky等[21]則將從受精卵到形態(tài)結(jié)構(gòu)與成體基本相似的烏賊的胚胎發(fā)育分為30個時期。綜合參考上述分期方法,筆者擬將日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程分為3個時期、8個階段,并對不同發(fā)育階段烏賊胚胎中的six3、eya、pax6基因相對表達水平進行分析。

    剛孵化的烏賊對視覺或氣味的提示會立即做出反應(yīng)并能表現(xiàn)出對某些重復(fù)視覺刺激的習(xí)慣,表明烏賊胚胎在孵化之前的發(fā)育過程中便能探測到刺激[6,22]。筆者探討分子水平日本無針烏賊胚胎期眼部發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因的表達變化,旨在查明烏賊相關(guān)調(diào)控基因?qū)ρ劬Πl(fā)育的影響機制,為探究烏賊的視覺機制,如烏賊快速適應(yīng)偽裝的視覺機制,同時為日本無針烏賊胚胎的人工繁育和增養(yǎng)殖提供分子水平數(shù)據(jù)參照。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    當(dāng)天產(chǎn)卵的日本無針烏賊卵采自中國南海汕頭海域,轉(zhuǎn)移至實驗室烏賊孵化養(yǎng)殖缸中培養(yǎng),養(yǎng)殖缸規(guī)格0.4 m×0.2 m×0.3 m,烏賊卵附著于尼龍繩上, 并在下方用塑料籃盛起,24 h人工增氧。孵化用水為砂濾海水,水溫(28±1) ℃,鹽度27±1,pH 7.5~8.2,連續(xù)充氣,每日換水,換水量為養(yǎng)殖缸的1/3[23]。

    自獲得烏賊卵當(dāng)日起,觀察和記錄每日培育狀況及養(yǎng)殖環(huán)境。同時,隨機挑取3~5顆烏賊卵,在體視顯微鏡(Nikon SMZ800N,Tokyo,Japan;目鏡C-W10×B/22,物鏡 Plan Apo 1×WF WD:70)下觀察和記錄,并進行分期及細分階段。每個階段取50顆烏賊卵,迅速用預(yù)冷的PBS溶液(Rnase free)沖洗,然后將每個卵分別保存于液氮預(yù)冷的滅菌密封袋中,立即置于液氮中冷凍3 h,置于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

    每個階段的日本無針烏賊胚胎各取6顆,于研缽中加液氮充分碾磨,每個胚胎轉(zhuǎn)移100 mg粉末于1.5 mL離心管中,采用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑盒提取總RNA,提取方法依據(jù)說明書進行操作。經(jīng)微量核酸測定儀(NanodropTMOne, Thermo ScientificTM, 美國)及凝膠電泳測定RNA質(zhì)量濃度及純度后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche,瑞士)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄方法依據(jù)說明書進行操作,反轉(zhuǎn)錄后cDNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 引物設(shè)計

    根據(jù)已構(gòu)建的日本無針烏賊轉(zhuǎn)錄組測序及注釋信息[18],結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中已報道的軟體動物基因組序列,采用Primer Premier 5.0軟件對six3、eya、pax6、gapdh(內(nèi)參)、rpl23a(內(nèi)參)基因進行引物設(shè)計,由通用生物公司設(shè)計合成,引物序列見表1。

    1.4 熒光定量PCR

    以提取到的8個階段烏賊樣品的cDNA(與轉(zhuǎn)錄組取樣一致,每個胚胎取100 mg)作為模板(n=6),以gapdh和rpl23a作為內(nèi)參基因,使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Foster, USA),通過BioRad公司的熒光定量PCR儀(CFX96 Touch, California, USA) 對six3、eya、pax6基因在不同階段的烏賊胚胎中的相對表達水平進行檢測。反應(yīng)程序為:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40 個循環(huán); 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s。每個樣品及內(nèi)參均設(shè)置 2個平行,采用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行處理,并根據(jù)Ct值,用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行分析。

    表1 試驗用引物序列

    1.5 統(tǒng)計分析

    對獲得的熒光定量結(jié)果采用SPSS 23軟件進行統(tǒng)計分析,差異顯著水平檢驗采用單因素方差分析,*表示差異顯著,其中,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程

    根據(jù)日本無針烏賊胚胎發(fā)育特征(圖1),及基因表達分析研究,將日本無針烏賊胚胎發(fā)育劃分為3個時期[受精卵—眼原基形成期(SJ1)、功能器官分化期(SJ2)、幼體孵化期(SJ3)]、8個階段[受精卵—胚芽原基及胚體形成(SJ1-1),口、漏斗原基出現(xiàn)(SJ2-2),眼點形成(SJ2-3),紅眼(SJ2-4),墨囊形成(SJ2-5),黑眼(SJ2-6),內(nèi)殼形成(SJ2-7),剛孵化幼體(SJ3-8)](表2)。

    圖1 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程特征觀察Fig.1 Observation of the developmental characteristics of embryos in Japanese spineless cuttlefish S. japonicaa~b.受精卵—眼原基形成期(SJ1-1); c~h.功能器官分化期(c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.幼體孵化期 (SJ3-8);放大倍數(shù)10×.a—b.fertilized egg-eye primordium formation period (SJ1-1); c—h.functional organ differentiation period (c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.larval incubation period (SJ3-8);magnification 10×.

    表2 日本無針烏賊胚胎發(fā)育過程

    2.2 日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育階段six3、eya、pax6基因表達分析

    基因表達分析結(jié)果表明,以gapdh、rpl23a為內(nèi)參,six3、eya基因表達量均隨烏賊胚胎發(fā)育從受精卵—眼原基形成期到幼體孵化期3個時期8個階段逐漸增加;six3基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期6個階段均顯著增加,功能器官分化期第7階段相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2、3階段均顯著增加;eya基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2階段顯著增加,功能器官分化期第7階段相比受精卵—眼原基形成期第1階段顯著增加。pax6基因相對表達量隨烏賊胚胎發(fā)育從受精卵—眼原基形成期到功能器官分化期有所增加,但從功能器官分化期第2階段開始直至幼體孵化期第8階段基因表達量逐漸降低;以gapdh基因為內(nèi)參,pax6基因在幼體孵化期第8階段相對表達量相比受精卵—眼原基形成期第1階段及功能器官分化期第2~6階段顯著降低,而以rpl23a基因為內(nèi)參,3期相對表達量無顯著差異(圖2)。

    圖2 日本無針烏賊不同胚胎發(fā)育階段six3、eya及pax6基因相對表達量(n=6)Fig.2 The relative transcript levels of six3,eya,and pax6 genes in different embryonic developmental stages of Japanese spineless cuttlefish S. japonica a~b.six3基因; c~d.eya基因; e~f.pax6基因; 圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;*.P<0.05, **.P<0.01.a—b.six3 gene; c—d.eya gene; e—f.pax6 gene; values are expressed as the mean±SD; *.P<0.05, **.P<0.01.

    3 討 論

    3.1 six3、eya及pax6基因在日本無針烏賊胚胎發(fā)育期中的表達量

    本項目組日本無針烏賊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[18]使用短reads組裝軟件Trinity組裝拼接后獲得58 054條Unigene,這些Unigene中,作為研究對象的six3基因,其Unigene長度為1220 nt,GC含量為48.61%;eya基因,其Unigene長度為4194 nt,GC含量為39.96%;pax6基因,其Unigene長度為1036 nt,GC含量為37.45%。根據(jù)每百萬Reads中來自某一基因每千堿基長度的Reads數(shù)目(RKPM)值計算,six3基因在3個時期中的表達RPKM均值為1.06;eya基因在3個時期中的RPKM均值為0.99;pax6基因在3個時期中的RPKM均值為0.40。根據(jù)高原等[24]對RPKM值劃分定義基因表達高低的方法,將基因表達量分為以下4個水平:中高表達量RPKM(30~+∞)、偏低表達量RPKM(3~30)、低表達量RPKM(1~3)、超低表達量RPKM(0~1)。本試驗中,日本無針烏賊胚胎eya基因及pax6基因在3個時期RPKM均值均在超低表達量RPKM(0~1)的區(qū)間中,即eya、pax6基因在胚胎發(fā)育3個時期的表達量均為超低表達量,six3基因在3個時期RPKM均值在低表達量RPKM(1~3)的區(qū)間中,即six3基因在胚胎發(fā)育3個時期的表達量均為低表達量,因此推測six3、eya、pax6 3個基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中以較低表達量進行調(diào)節(jié)作用,如six3以較低表達量調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜發(fā)育,而過表達則可引起某些特定細胞亞群的擴增[25-29]。

    3.2 雙內(nèi)參基因gapdh、rpl23a在six3、eya及pax6基因表達分析中的應(yīng)用

    根據(jù)Pfaffl等[30-31]基因穩(wěn)定性測量方法,本試驗在基因表達分析中,采用雙內(nèi)參基因gapdh、rpl23a對數(shù)據(jù)進行歸一化處理。在six3、eya基因表達分析中,以gapdh及以rpl23a為內(nèi)參基因結(jié)果一致,內(nèi)參基因受候選基因表達強度影響較小,而在pax6基因表達分析中,以rpl23a為內(nèi)參基因,所分析各時期樣品的表達水平變化較以gapdh為內(nèi)參基因各時期樣品的表達水平變化大,但無顯著性差異出現(xiàn),表達趨勢一致。目前有關(guān)日本無針烏賊基因表達分析內(nèi)參基因選擇報道較少,該結(jié)果有助于日本無針烏賊基因表達分析選擇穩(wěn)定的參考基因。

    3.3 six3、eya及pax基因在日本無針烏賊眼睛發(fā)育中的調(diào)控作用

    脊椎動物眼形態(tài)的發(fā)生受到包括six、eya及pax在內(nèi)的幾個重要基因的調(diào)控,它們在脊椎動物和果蠅的視網(wǎng)膜前體細胞分化及增殖,光感受器神經(jīng)元細胞的維護中起著關(guān)鍵作用[32]。Koenig等[33]研究顯示,與脊椎動物一樣,頭足類動物中six3及eya基因參與晶狀體的形成,頭足類動物中six3及eya基因在胚胎發(fā)育早期眼區(qū)(如胚胎的眼基、視葉)及在胚胎發(fā)育后期胚基板和蓋的邊緣可觀察到有明顯表達。本試驗中,six3、eya基因在日本無針烏賊不同胚胎發(fā)育時期及階段的相對表達量結(jié)果顯示,six3、eya基因在眼原基形成期有微量表達,并隨胚胎發(fā)育,從眼原基形成期到幼體孵化期8個階段相對表達量逐漸顯著增加,表明six3、eya在日本無針烏賊眼睛發(fā)育中同樣起重要作用。

    在脊椎動物胚胎發(fā)育期,pax6基因在視網(wǎng)膜發(fā)育后期的腺管和神經(jīng)節(jié)細胞中表達[34]。在魷魚胚胎發(fā)育期,pax6基因被認為是眼形成通用主控基因,參與光感器官的發(fā)育,pax6基因在加州魷魚(Loligoopalescens)眼睛發(fā)育過程中的表達方式與果蠅無眼基因表達方式類似,無眼基因在果蠅眼盤未分化前體細胞中表達活躍,在眼盤后端形成形態(tài)溝后的分化細胞中表達明顯下降,pax6基因在加州魷魚光區(qū)外胚層和中胚層表達明顯,而在分化的視網(wǎng)膜細胞中無表達[35]。本試驗中,pax6基因在日本無針烏賊胚胎發(fā)育功能器官分化期表達量增加,在眼點形成前期眼柄突出時表達最活躍,隨胚胎發(fā)育視網(wǎng)膜細胞分化表達逐漸降低,與加州魷魚中pax6基因表達相似,而pax6基因在日本無針烏賊眼睛發(fā)育后期調(diào)控與脊椎動物不同[36]。

    3.4 six3、eya、pax6基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)作用

    six3、eya、pax6基因在日本無針烏賊眼原基形成期、功能器官分化期及幼體孵化期3個胚胎發(fā)育時期8個階段不同程度的表達水平表明,這3個基因在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。有研究表明,eya基因表達的EYA蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其在胚胎發(fā)育過程中對組織和器官的特異性分化具有重要調(diào)控作用[37-38],EYA蛋白可以與SIX蛋白發(fā)生直接相互作用[39-40],作為SIX蛋白的共激活因子激活SIX[41],因而推測基因功能關(guān)聯(lián)性可能與six3、eya基因相對表達量均從眼原基形成期到幼體孵化期逐漸顯著增加相關(guān)。頭足類動物中,pax6基因調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)上游[36],同時,有研究表明,在哺乳動物眼睛晶狀體誘導(dǎo)和分化過程中,six3為pax6的下游調(diào)控基因,激活了pax6等相關(guān)基因的表達[42-43],而在日本無針烏賊胚胎發(fā)育中,pax6基因也在較早時期(眼原基形成期至功能器官分化期)相對表達量較高,基因相對表達量在功能分化基本完成后(幼體孵化期)顯著降低。

    筆者僅對日本無針烏賊胚胎不同發(fā)育階段3個眼部相關(guān)基因進行了分析研究,有關(guān)不同發(fā)育階段眼部組織學(xué)特征及不同發(fā)育階段眼部不同部位這3個基因的表達有待進一步分析。

    4 結(jié) 論

    根據(jù)日本無針烏賊胚胎3個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)eya、pax6基因在3個發(fā)育時期均為超低表達量基因,six3基因在3個發(fā)育時期為低表達量基因。3個基因在日本無針烏賊胚胎3個發(fā)育時期8個階段的相對表達量變化表明其在基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。日本無針烏賊胚胎眼部發(fā)育過程所涉及的基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)機制尚未查明,筆者從胚胎3個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中尋找與胚胎生長發(fā)育,器官功能分化等相關(guān)基因進行分析,并對每一階段的基因變化進行研究探討,為構(gòu)建基因轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò),了解調(diào)控機制提供數(shù)據(jù)支持,同時也為日本無針烏賊胚胎的人工繁育和增養(yǎng)殖提供有效的數(shù)據(jù)參照。

    猜你喜歡
    形成期無針原基
    打針也溫柔
    基于群體Parrondo博弈的根分枝建模方法
    立足校園 生生不息地“延長”
    胰島素注射,無針與有針該咋選
    保幼激素和蛻皮激素對家蠶翅原基生長分化的影響
    Evaluation on formation rate of Pleurotus eryngii primordium under different humidity conditions by computer vision
    無針注射器在胰島素注射中的應(yīng)用研究進展
    護理研究(2017年6期)2017-02-28 19:41:16
    干旱條件下生物炭施用量對馬鈴薯塊莖形成期土壤速效養(yǎng)分含量的影響
    中國馬鈴薯(2015年3期)2015-12-19 08:03:54
    無針注射器
    網(wǎng)絡(luò)輿論整體過程及各個時期的心理效應(yīng)分析
    今傳媒(2015年12期)2015-05-30 05:12:32
    亚洲欧洲日产国产| av不卡在线播放| 免费观看性生交大片5| 激情五月婷婷亚洲| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 捣出白浆h1v1| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲伊人色综图| 国产日韩欧美视频二区| 不卡av一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 美国免费a级毛片| 婷婷色综合www| 精品国产国语对白av| 国产一区二区 视频在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 天美传媒精品一区二区| 久久青草综合色| 中文字幕av电影在线播放| 国精品久久久久久国模美| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 91精品伊人久久大香线蕉| 人人澡人人妻人| 看免费av毛片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | av线在线观看网站| 男女午夜视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 天堂8中文在线网| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久韩国三级中文字幕| 精品久久久精品久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲综合精品二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 最近的中文字幕免费完整| 在线观看www视频免费| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久韩国三级中文字幕| 老司机亚洲免费影院| 国产免费视频播放在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丰满少妇做爰视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产麻豆69| 亚洲国产av新网站| 视频区图区小说| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久久久久久久大奶| 久久久国产一区二区| 精品久久久精品久久久| 在线观看人妻少妇| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 狂野欧美激情性xxxx| 一本久久精品| 搡老岳熟女国产| 国产成人精品在线电影| 亚洲天堂av无毛| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成人漫画全彩无遮挡| 一边摸一边做爽爽视频免费| 深夜精品福利| 婷婷色综合大香蕉| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲图色成人| 精品国产乱码久久久久久男人| 性少妇av在线| 午夜日韩欧美国产| 久久人人爽人人片av| 美女福利国产在线| av天堂久久9| 热re99久久国产66热| 国产精品国产三级国产专区5o| 纯流量卡能插随身wifi吗| 高清在线视频一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 18禁国产床啪视频网站| 女性生殖器流出的白浆| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 少妇的丰满在线观看| 国产视频首页在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品熟女久久久久浪| 一区二区三区激情视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 美女国产高潮福利片在线看| 老司机靠b影院| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲第一av免费看| 在线精品无人区一区二区三| 岛国毛片在线播放| 久久精品国产亚洲av高清一级| 青草久久国产| e午夜精品久久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品国产三级国产专区5o| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 性色av一级| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩一区二区视频免费看| 日韩视频在线欧美| a级片在线免费高清观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 视频区图区小说| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产一区二区 视频在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 老司机在亚洲福利影院| 美女视频免费永久观看网站| 韩国精品一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 悠悠久久av| www.自偷自拍.com| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩大片免费观看网站| 人人澡人人妻人| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黄色视频不卡| 一级片免费观看大全| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黑人猛操日本美女一级片| 丁香六月欧美| 欧美日韩av久久| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩视频在线欧美| 久久av网站| av.在线天堂| 只有这里有精品99| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久久精品性色| 亚洲精品第二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜91福利影院| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 韩国精品一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 国产毛片在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 国产一区二区三区av在线| 久久久久视频综合| 9色porny在线观看| 美女福利国产在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 999久久久国产精品视频| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| av网站免费在线观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久精品性色| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 电影成人av| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久久久久国产电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 黄色视频不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜老司机福利片| 男女边吃奶边做爰视频| 男男h啪啪无遮挡| 99热全是精品| 免费黄网站久久成人精品| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产一区二区三区综合在线观看| 熟女av电影| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲在久久综合| 90打野战视频偷拍视频| 街头女战士在线观看网站| 亚洲综合色网址| 看免费av毛片| 下体分泌物呈黄色| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩欧美一区视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 中文欧美无线码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产欧美网| av国产久精品久网站免费入址| 免费日韩欧美在线观看| 国产乱人偷精品视频| 不卡视频在线观看欧美| 天天操日日干夜夜撸| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产视频首页在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 99久国产av精品国产电影| av线在线观看网站| 国产一卡二卡三卡精品 | av一本久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜免费观看性视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 最黄视频免费看| 伦理电影免费视频| 久久精品国产综合久久久| av不卡在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人精品无人区| 色吧在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 激情视频va一区二区三区| 男女无遮挡免费网站观看| 波野结衣二区三区在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费不卡黄色视频| 久久久久久久精品精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 天天影视国产精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 观看av在线不卡| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲少妇的诱惑av| 两个人免费观看高清视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 美女主播在线视频| 欧美久久黑人一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 伊人久久国产一区二区| 看十八女毛片水多多多| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产精品一区三区| 女性被躁到高潮视频| tube8黄色片| 欧美日韩综合久久久久久| 99精品久久久久人妻精品| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 十八禁高潮呻吟视频| 色94色欧美一区二区| 国产精品一国产av| 人人澡人人妻人| 国产乱来视频区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人免费观看mmmm| 日本爱情动作片www.在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 99香蕉大伊视频| 青青草视频在线视频观看| 久热爱精品视频在线9| 国产又爽黄色视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 99热网站在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 99热全是精品| 久久亚洲国产成人精品v| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费av中文字幕在线| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品国产av在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 777久久人妻少妇嫩草av网站| tube8黄色片| 欧美xxⅹ黑人| 2018国产大陆天天弄谢| 丝袜脚勾引网站| 亚洲少妇的诱惑av| 久久精品人人爽人人爽视色| 十八禁人妻一区二区| 欧美久久黑人一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美精品一区二区免费开放| 免费av中文字幕在线| 欧美日韩精品网址| 男女无遮挡免费网站观看| 精品福利永久在线观看| 午夜久久久在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产又爽黄色视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人手机av| 精品午夜福利在线看| 咕卡用的链子| av线在线观看网站| 最近中文字幕2019免费版| 99久久精品国产亚洲精品| 久久精品国产综合久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美成人午夜精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 91国产中文字幕| 亚洲,一卡二卡三卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩一级在线毛片| 久久精品久久精品一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线天堂中文资源库| 最黄视频免费看| 99久久综合免费| 久久久久久人人人人人| 欧美最新免费一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | a 毛片基地| 赤兔流量卡办理| 成人手机av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看www视频免费| 成人亚洲精品一区在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲成人免费av在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲国产看品久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品久久久久久电影网| 高清欧美精品videossex| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品 国内视频| 精品一区在线观看国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 又大又爽又粗| 国产一区二区激情短视频 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 成人手机av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人欧美| 国产男女超爽视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一二三四在线观看免费中文在| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲熟女精品中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕亚洲精品专区| 精品国产露脸久久av麻豆| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 超碰成人久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 一区二区三区四区激情视频| av在线app专区| 交换朋友夫妻互换小说| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产在线一区二区三区精| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄片播放在线免费| 国产日韩欧美亚洲二区| 美女大奶头黄色视频| 久久99热这里只频精品6学生| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 毛片一级片免费看久久久久| 日本欧美视频一区| 只有这里有精品99| 精品国产国语对白av| 日韩电影二区| 91国产中文字幕| 9191精品国产免费久久| 亚洲视频免费观看视频| 一区二区av电影网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品酒店卫生间| 国产成人欧美在线观看 | 综合色丁香网| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产亚洲最大av| 18禁观看日本| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美日韩一级在线毛片| 不卡av一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品久久久久成人av| 18禁国产床啪视频网站| 99热网站在线观看| 少妇 在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品一国产av| 亚洲精品日本国产第一区| 久久av网站| 十分钟在线观看高清视频www| 十分钟在线观看高清视频www| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 中文字幕av电影在线播放| 在线观看免费视频网站a站| 美女主播在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲成人手机| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一级毛片我不卡| 亚洲久久久国产精品| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 丝袜人妻中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 久久天堂一区二区三区四区| 成人国语在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品久久二区二区91 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久精品久久精品一区二区三区| avwww免费| 99热国产这里只有精品6| a级毛片黄视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品一区在线观看国产| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲男人天堂网一区| 狂野欧美激情性xxxx| 免费看av在线观看网站| 亚洲av日韩在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 久热这里只有精品99| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 女性被躁到高潮视频| 亚洲中文av在线| 国产精品 欧美亚洲| 韩国精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 我要看黄色一级片免费的| 在线精品无人区一区二区三| 狂野欧美激情性xxxx| 18禁动态无遮挡网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久久久久久精品精品| avwww免费| 成人国语在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 老司机亚洲免费影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人av激情在线播放| av视频免费观看在线观看| 成人国语在线视频| 中文字幕亚洲精品专区| 十八禁人妻一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久网色| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品国产av在线观看| 国产男人的电影天堂91| av在线app专区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 中国三级夫妇交换| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 免费黄色在线免费观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 嫩草影院入口| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久精品国产欧美久久久 | 十分钟在线观看高清视频www| 国产一级毛片在线| 亚洲精品自拍成人| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 女人久久www免费人成看片| 欧美久久黑人一区二区| 精品视频人人做人人爽| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产成人系列免费观看| 免费观看a级毛片全部| 国产一级毛片在线| 七月丁香在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品酒店卫生间| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男的添女的下面高潮视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看一区二区三区激情| 国产视频首页在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 久久青草综合色| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 丝袜喷水一区| 高清av免费在线| 亚洲第一青青草原| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av综合色区一区| 午夜老司机福利片| h视频一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产亚洲最大av| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av综合色区一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 9热在线视频观看99| 高清黄色对白视频在线免费看| 日本欧美国产在线视频| 最近中文字幕2019免费版| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久久久久久久久久免费av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99re6热这里在线精品视频| 黄片播放在线免费| 18禁国产床啪视频网站| 国产片内射在线| 免费少妇av软件| 成人国产av品久久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 秋霞在线观看毛片| 午夜日本视频在线| 9热在线视频观看99| 欧美激情高清一区二区三区 | 高清视频免费观看一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 国产不卡av网站在线观看| 中国国产av一级| kizo精华| 在线观看国产h片| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级毛片电影观看| 精品一品国产午夜福利视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 99香蕉大伊视频| 黄色 视频免费看| 成人黄色视频免费在线看| 另类精品久久| 黄片无遮挡物在线观看|