基于瘀毒互結(jié)病機(jī)理論探討隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的作用機(jī)制

杜仲燕 魯軍 趙正奇 張光霽

胃癌（Gastric cancer，GC）是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤?！?020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》［1］顯示，全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率（5.6%）居第5位，死亡率（7.7%）排第4位。近年來(lái)，隨著診斷前移與治療方式的多樣化，早期胃癌患者的生存率有所提高，但晚期胃癌患者的預(yù)后仍然較差，中位生存期約為1年［2-4］。目前，中醫(yī)中藥在腫瘤進(jìn)展、腫瘤耐藥、改善癥狀等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，得到廣泛關(guān)注。深入挖掘中醫(yī)中藥在胃癌治療中的潛在靶點(diǎn)，闡明胃癌治療的分子作用機(jī)制，已然成為研究的重點(diǎn)。基于大量的理論、實(shí)驗(yàn)和臨床研究，張光霽教授創(chuàng)新性提出“久病必瘀、因瘀致毒、因毒致變、瘀毒互結(jié)”是中醫(yī)腫瘤的核心病機(jī)之一，化瘀攻毒、瘀毒同治是中醫(yī)腫瘤的主要治法［5］。本研究基于瘀毒互結(jié)病機(jī)理論，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具探討隱丹參酮聯(lián)合三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點(diǎn)和分子作用機(jī)制，以期為新藥研發(fā)和腫瘤臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)工具 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)［6］（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取隱丹參酮相關(guān)靶點(diǎn)，Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）獲取三氧化二砷相關(guān)靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）、DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.disgenet.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（（http：//www.omim.org）獲取胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，Draw Venn Diagrams（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取隱丹參酮合用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點(diǎn)，STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）進(jìn)行PPI分析，Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建藥物和疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，R clusterProfiler進(jìn)行GO和KEGG富集分析，Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)校準(zhǔn)。以上工具的使用時(shí)間截止至2021年5月。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖，見(jiàn)圖1。

圖1 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的研究路線圖

1.2 研究方法 （1）隱丹參酮與三氧化二砷靶點(diǎn)的獲?。阂訡ryptotanshinone為檢索詞，通過(guò)TCMSP工具，檢索隱丹參酮的相關(guān)靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot工具進(jìn)行校準(zhǔn)；以Arsenic Trioxide為檢索詞，通過(guò)Drugbank工具，檢索到三氧化二砷的相關(guān)靶點(diǎn)，并匯總靶點(diǎn)的Gene Name和Uniprot ID。（2）胃癌靶點(diǎn)的獲?。阂浴癎astric Cancer”為檢索詞，通過(guò)GeneCards、DisGeNet和OMIM工具，檢索胃癌的相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)Draw Venn Diagrams工具去重后得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)的合集。（3）藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析：通過(guò)Draw Venn Diagrams工具，獲取隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Cytoscape工具，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。（4）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建：通過(guò)STRING工具，把隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相關(guān)作用靶點(diǎn)上傳至工具，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。（5）GO與KEGG富集分析：通過(guò)R clusterProfiler，分析隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相關(guān)作用靶點(diǎn)的GO功能注釋與KEGG信號(hào)通路富集。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮與三氧化二砷的靶點(diǎn) 獲取隱丹參酮的相關(guān)靶點(diǎn)共30個(gè)，獲取三氧化二砷靶點(diǎn)10個(gè)，去重后共有39個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

2.2 胃癌靶點(diǎn) 通過(guò)GeneCards、DisGeNet和OMIM工具檢索，分別獲取胃癌靶點(diǎn)12153個(gè)、34個(gè)、505個(gè)，去重后共為12511個(gè)，見(jiàn)圖2A。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌映射得到38個(gè)共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2B。

圖2 胃癌靶點(diǎn)與隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 通過(guò)Cytoscape工具構(gòu)建隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的相互作用關(guān)系的可視化網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)不同的藥物可作用于相同的靶點(diǎn)，也可作用于不同的靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。見(jiàn)圖3。

圖3 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了更好地理解隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系并使用STRING工具構(gòu)建隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。PPI網(wǎng)絡(luò)包含38個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，196條相互作用關(guān)系（連線），其中SCN5A與其他蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)無(wú)相互作用關(guān)系。通過(guò)R語(yǔ)言計(jì)算靶點(diǎn)的degree，并繪制barplot圖，顯示MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA為排名前十的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖5。

圖4 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌排名前十的核心靶點(diǎn)

2.5 藥物-疾病靶點(diǎn)GO分析 根據(jù)隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，得到靶點(diǎn)具有的功能信息62條（P＜0.05），按P值選取前20條，見(jiàn)圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其功能涉及泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性、血清素受體活性、RNA聚合酶II特異的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

圖6 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌靶點(diǎn)的GO分析

2.6 藥物-疾病靶點(diǎn)KEGG分析 以P＜0.05進(jìn)行篩選，得到139條信號(hào)通路，按P值選取前20條，并按通路富集靶點(diǎn)個(gè)數(shù)排序。其中，前20條KEGG通路為TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號(hào)通路、膽堿能突觸、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑等，表明隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷的有效成分可能通過(guò)作用以上通路來(lái)治療胃癌。其中，核心靶點(diǎn)RelA在TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、cAMP信號(hào)通路等16條信號(hào)通路中均有涉及。見(jiàn)圖7和表1。

表1 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌潛在靶點(diǎn)的KEGG通路分析

圖7 隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌靶點(diǎn)的KEGG分析

3 討論

胃癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率與死亡率居高不下，晚期胃癌患者的預(yù)后較差、生存期較短，嚴(yán)重威脅人類的生命健康［7］。近年來(lái)，中醫(yī)中藥治療胃癌的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯，是腫瘤精準(zhǔn)化醫(yī)療發(fā)展、多靶點(diǎn)藥物發(fā)現(xiàn)的源泉，而且蘊(yùn)藏著巨大的新藥創(chuàng)制資源［8］。中醫(yī)學(xué)雖無(wú)“胃癌”之病名，但可歸于“胃脘痛”“癥瘕”“積聚”“痞證”“脾積”等范疇?！吨T病源候論》［9］曰：“血瘀于內(nèi)，時(shí)時(shí)體熱面黃，瘀久不消，則變成積聚癥瘕也”，《仁齋直指方論》［10］曰：“癌者上高下深，巖穴之狀……毒根深藏，穿孔透里”。瘀為毒之基，毒為瘀之甚，瘀可蘊(yùn)毒、毒復(fù)致瘀，最終導(dǎo)致瘀毒互結(jié)。張光霽教授認(rèn)為胃癌病因病機(jī)復(fù)雜，往往交雜互結(jié)為患，核心病機(jī)為瘀毒互結(jié)，治宜化瘀攻毒、瘀毒同治。

丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效，多用于治療癥瘕積聚、脘腹脅痛等疾病［11］。隱丹參酮由丹參的干燥根和根莖中提取而來(lái)，是丹參有效成分之一，是一種具有多種藥理作用的天然喹諾酮二萜［12］。砒霜是以毒攻毒治癌中藥的代表藥，三氧化二砷是其主要活性成分。研究證實(shí)，隱丹參酮和三氧化二砷可用于胃癌等多種惡性腫瘤的治療［13-15］，但具體作用機(jī)制不明。本研究旨在探討隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的具體分子作用機(jī)制，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論采用TCMSP、Drugbank、GeneCards等工具篩選出隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌的潛在靶點(diǎn)共38個(gè)，分別為 MAPK3、AKT1、APP、JUN、STAT3、EDN1、TNF、CCND1、MAPK1、RELA等，涉及G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯(lián)的血清素受體活性、血清素受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、肽結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等GO富集分析，涉及cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、癌癥中PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)途徑等炎癥、代謝、免疫方面。

通過(guò)STRING和R語(yǔ)言工具篩選得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)排名前十的核心靶點(diǎn)，RelA為其中之一。RelA雖為隱丹參酮的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，但通過(guò)隱丹參酮與三氧化二砷的聯(lián)用，與16個(gè)靶點(diǎn)相互作用，并在排名前20的GO分析中參與了泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等6個(gè)GO過(guò)程，在排名前20的KEGG通路中參與了TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等16條信號(hào)通路。RelA為核轉(zhuǎn)錄因子 -κB/p65（Nuclear Factor-kappa B/p65，NF-κB/p65），是最重要的功能亞基［16］，在人體胃癌組織中RelA核易位顯著增高，NF-κB被激活。NF-κB是免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中的一種重要調(diào)控蛋白，NF-κB的不適當(dāng)激活與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和化療敏感性密切相關(guān)［17］。泛素化作用可影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，從而調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞過(guò)程，泛素化機(jī)制的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致胃癌等多種惡性腫瘤，RelA多個(gè)賴氨酸殘基存在泛素化修飾，在腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子7作用下促進(jìn)泛素化，并進(jìn)行溶酶體內(nèi)降解，從而抑制NF-κB活性［18］，而隱丹參酮和三氧化二砷均可抑制NF-κB活化［19-20］。由此推測(cè)，隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷治療胃癌可能是通過(guò)靶向RelA，并促其泛素化，從而抑制NF-κB活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

NF-κB抑制劑在臨床上被廣泛應(yīng)用于胃癌的治療，但由于NF-κB信號(hào)通路在機(jī)體內(nèi)的交互性和復(fù)雜性，廣泛抑制其活性會(huì)帶來(lái)較多的不良反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB抑制劑的臨床療效并不理想，這也促使著科研工作者去尋找更精準(zhǔn)的NF-κB抑制劑。隱丹參酮聯(lián)用三氧化二砷有可能成為精準(zhǔn)治療胃癌的新型藥物，考慮到網(wǎng)路藥理學(xué)工具的預(yù)測(cè)特殊性，本研究將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中夯實(shí)預(yù)測(cè)，為中醫(yī)病機(jī)理論的臨床應(yīng)用實(shí)踐提供科學(xué)的依據(jù)與參考。