葒草花提取物對H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷的改善作用

李月婷 劉亭 吳瓊 陸定艷 王明金 王永林 李勇軍 周孟 劉春花

摘 要 目的：研究葒草花提取物對H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷的的改善作用及機制。方法：將H9c2心肌細胞為正常對照組、模型組和葒草花提取物低、中、高濃度組（20、40、80 μg/mL），除正常對照組外，其余各組細胞以800 μmol/L CoCl2復制缺氧復氧損傷模型，然后觀察細胞凋亡情況，并分別檢測細胞中ROS水平、鈣離子水平（細胞質(zhì)中）、線粒體膜電位（MMP）水平、ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶）活性、細胞質(zhì)中細胞色素c（Cyto c）/線粒體中Cyto c比值、再灌注補救激酶（RISK）信號通路相關蛋白[蛋白激酶B（Akt）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）]的磷酸化水平以及缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的蛋白表達水平。另取細胞分為正常對照組、模型組、葒草花提取物組（80 μg/mL）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002+CoCl2組（15 μmol/L LY294002+800 μmol/L CoCl2）、LY294002+葒草花提取物組（15 μmol/L LY294002+80 μg/mL葒草花提取物）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑PD98059+CoCl2組（25 μmol/L PD98059+800 μmol/L CoCl2）、PD98059+葒草花提取物組（25 μmol/L PD98059+80 μg/mL葒草花提取物），同法培養(yǎng)后，測定細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平，以驗證葒草花提取物對RISK信號通路的激活作用。結(jié)果：與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細胞的細胞核固縮現(xiàn)象減輕，凋亡小體數(shù)量減少;細胞中ROS水平、鈣離子水平（低濃度組除外）、MMP、細胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值和HIF-1α的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;ATP酶活性（低濃度組除外）、Akt蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01）。加入抑制劑LY294002、PD98059后，細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：葒草花提取物可改善H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷，其作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡、提高ATP酶活性、保護線粒體、調(diào)節(jié)RISK信號通路相關蛋白和HIF-1α蛋白表達有關。

關鍵詞 葒草花提取物;H9c2心肌細胞;缺氧復氧損傷;補救激酶信號通路;缺氧誘導因子1α

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and mechanism of Polygonum orientale flower extract on hypoxia- reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes. METHODS： H9c2 cardiomyocytes were divided into normal control group， model group and low-， medium- and high-concentrations groups of P. orientale flower extract （20， 40， 80 μg/mL）. Except for normal control group， other groups were given 800 μmol/L CoCl2 to induce hypoxia-reoxygenation injury model. Cell apoptosis was observed. The levels of Ca2+ （in cytoplasm）， mitochondrial membrane potential （MMP）， ATP enzyme （Na+-K+-ATP enzyme， Ca2+-Mg2+-ATP enzyme） activities， the ratio of cytochrome c（Cyto c）? ?protein in cytosol to mitochondria， phosphorylation levels of reperfusion injury salvage kinase （RISK） signaling pathway related protein [protein kinase B （Akt） and extracellular signal regulated kinase 1/2 （ERK1/2）] as well as protein expression of HIF-1α were detected respectively. In addition， the cells were divided into normal control group， model group and P. orientale flower extract group （80 μg/mL）， PI3K inhibitor LY294002+CoCl2 group （15 μmol/L LY294002+80 μmol/L CoCl2），? LY294002+P. orientale flower extract group （15 μmol/L LY294002+80 μg/mL P. orientale flower extract）， MEK inhibitor PD98059+CoCl2 group （25 μmol/L PD98059+800 μmol/L CoCl2）， PD98059+P. orientale flower extract group （25 μmol/L PD98059+80 μg/mL P. orientale flower extract）. After cultured by the same method， the phosphorylation levels of Akt protein and ERK1/2 protein in the cells were measured to verify the activation of P. orientale flower extract to RISK signaling pathway. RESULTS： Compared with model group， nuclear pyknosis and the number of apoptotic bodies were reduced in different concentrations groups of P. orientale flower extract. ROS level， Ca2+ level （except for low-concentration group）， MMP， ratio of Cyto c in cytoplasm to Cyto c in mitochondria， protein expression of HIF-1α were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the activity of ATP enzyme （except for the low-concentration group）， Akt protein and ERK1/2 protein phosphorylation level were significantly increased （P<0.01）. After treated with PI3K inhibitor LY294002 and MEK inhibitor PD98059， Akt protein and ERK1/2 protein phosphorylation level in cadiomyocyte were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： P. orientale flower extract can improve hypoxia-reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes， the mechanism of which may be associated with inhibiting cardiomyocyte apoptosis， improving ATPase activity， protecting mitochondria， regulating RISK signaling pathway related proteins and HIF-1α protein expression.

KEYWORDS? ?Polygonum orientale flower extract; H9c2 cardiomyocytes; Hypoxia-reoxygenation injury; RISK signaling pathway; HIF-1α

葒草為蓼科植物葒草Polygonum orientale L.的干燥果穗及帶葉莖枝，其味辛，性涼，有小毒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、祛風除濕、活血消腫的功效，常用于治療風濕性關節(jié)炎、冠心病、心胃氣痛、疝氣、腳氣、瘡腫[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草的花序（即葒草花）具有明顯的抗心肌缺血、抗氧化損傷的作用[2-5]，且對H9c2心肌細胞的過氧化氫損傷和缺氧復氧損傷具有明顯的改善作用[3-4]。但是，葒草花抗心肌細胞缺氧復氧損傷的作用機制尚不明確。

線粒體在參加和調(diào)節(jié)心肌細胞的損傷方面發(fā)揮著重要作用[6]。嚴重的缺氧環(huán)境會損傷線粒體的電子傳遞鏈[7]，從而損傷線粒體，因此在復氧過程中，由于受損線粒體的驅(qū)動，使得大量活性氧（ROS）產(chǎn)生、鈣離子失調(diào)，進而改變線粒體的通透性，導致線粒體腫脹和損傷[6，8];另外，受損的線粒體還可導致線粒體的功能失調(diào)，從而釋放細胞色素 c（Cyto c）進入細胞質(zhì)，激活級聯(lián)凋亡反應[9]，進而激活線粒體的重構(gòu)和細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞存亡的反應[6]，最終導致細胞的凋亡和壞死。因此，保護線粒體是治療心肌細胞損傷的重要環(huán)節(jié)。

Hausenloy等[10]提出了再灌注損傷補救激酶（RISK）的概念，且相關研究已經(jīng)證實RISK信號通路在心肌缺血/再灌注損傷中具有關鍵作用[11]。RISK由磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）這兩條信號通路組成，當RISK被激活時，可顯著減少心肌梗死面積，因而是眾多生長因子、細胞因子以及藥物干預的靶點[11-13]。缺氧誘導因子1α（HIF-1α）是缺氧轉(zhuǎn)錄反應的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，對細胞耐受缺氧環(huán)境和維持氧平衡具有重要作用，且與心肌細胞損傷的發(fā)生機制有關[14]。

基于此，本研究采用氯化鈷（CoCl2）誘導H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷，然后檢測葒草花提取物對其細胞中ROS水平、鈣離子水平（細胞質(zhì)中）、線粒體膜電位（MMP）、腺苷三磷酸（ATP）酶活性、Cyto c蛋白表達（細胞質(zhì)和線粒體中）、RISK信號通路相關蛋白及HIF-1α蛋白表達等的影響，并應用PI3K抑制劑LY294002（簡稱“LY”）和絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑PD98059（簡稱“PD”）[15-16]，驗證葒草花提取物對RISK信號通路的激活作用，從而探討葒草花改善H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷的作用機制，為其進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Forma 321 型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），Model 680型酶標儀、Trans-Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Power Pac Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司），Allegra 64R型冷凍高速離心機（美國Beckman公司），GBOX chemi XL1.4型凝膠成像儀（英國Sysgene公司），R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

葒草花藥材采收于貴州省貴陽市鹿沖關植物園，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院中藥民族藥標本館龍慶德副教授鑒定為蓼科植物葒草P. orientale的干燥花序。其他藥品與試劑有：BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號PC0020-500），磷酸鹽緩沖液（PBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為10010049、12430047、R001100、12664025），抑制劑LY、抑制劑PD、CoCl2、二甲基亞砜（美國Sigma公司，批號分別為L9908、P215、255599、D2447），ROS檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、Hoechst 33342染液、Fluo-4 AM鈣離子熒光探針、BSA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為S0033S、C2006、C1026、S1060、ST025），ATP酶試劑盒（美國Promega公司，批號V7001），細胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒（中國Sangon Biotech公司，批號C500051-0050），小鼠源β-actin單克隆抗體、兔源Cyto c單克隆抗體、兔源Akt多克隆抗體、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體、兔源ERK單克隆抗體、兔源磷酸化ERK（p-ERK）多克隆抗體、兔源HIF-1α單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（英國Abcam公司，批號分別為ab8226、ab133504、ab38449、ab8805、ab184699、ab217322、ab179483、ab6721、ab6728），PVDF膜（美國Millipore公司，批號IPVH00010）;其余試劑為實驗室常用試劑，水為純凈水。

1.3 細胞

本研究所用細胞為大鼠H9c2心肌細胞株，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 葒草花提取物的制備

參照本課題組前期研究方法[17]，取葒草花藥材7.0 kg，經(jīng)水提、醇沉后，以水飽和正丁醇溶液萃取，收集正丁醇層，減壓干燥;殘渣以80%乙醇溶解，然后上聚酰胺柱，以80%乙醇進行洗脫;收集洗脫液，減壓回收乙醇，殘留物采用微波真空干燥器進行干燥，即得葒草花提取物（得率為3.43%）。

2.2 細胞培養(yǎng)

將H9c2心肌細胞接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（下同），待細胞生長至85%時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 分組、造模與給藥

參考文獻[3]方法復制缺氧復氧損傷模型。將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上清液;將細胞分為正常對照組、模型組和葒草花提取物低、中、高濃度組（20、40、80 μg/mL，以提取物計，藥物質(zhì)量濃度根據(jù)課題組前期研究設置[3-4]）。模型組細胞加入完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為800? ? ? ?μmol/L的CoCl2溶液（臨用時以完全培養(yǎng)基溶解制成），培養(yǎng)22 h以刺激細胞，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h;葒草花提取物低、中、高濃度組細胞分別加入終濃度分別為20、40、80 μg/mL的葒草花提取物溶液（臨用時以完全培養(yǎng)基溶解制成）100 μL，培養(yǎng)24 h后，按上述“加入終濃度為800 μmol/L的CoCl2溶液……換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h”方法操作;正常對照組細胞以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)時間與方法同模型組，但不進行造模。

2.4 H9c2心肌細胞凋亡的觀察

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基;以PBS洗滌2次，每孔加入1×Hoechst 33342染色液1 mL，培養(yǎng)20 min;棄去含染料的培養(yǎng)基，以無血清高糖DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后，采用熒光顯微鏡觀察并拍照（正常細胞的細胞核被染成均勻的藍色，凋亡細胞的細胞核呈碎裂、濃縮的明亮藍色）。

2.5 H9c2心肌細胞中ROS水平的檢測

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基;按ROS檢測試劑盒說明書方法操作后，采用熒光顯微鏡進行觀察，并隨機選取5個不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其綠色熒光強度，以評價細胞中ROS水平（綠色熒光強度越大，則表示細胞中ROS水平越高）。

2.6 H9c2心肌細胞中鈣離子水平（細胞質(zhì)中）的檢測

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌3次;按Fluo-4 AM鈣離子熒光探針檢測試劑盒說明書方法操作后，采用熒光顯微鏡觀察，并隨機選取5個不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其綠色熒光強度，以評價細胞質(zhì)中鈣離子水平（綠色熒光強度越大，則表示細胞質(zhì)中鈣離子水平越高）。

2.7 H9c2心肌細胞MMP的檢測

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌1次;按JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書方法操作后，采用熒光顯微鏡觀察并拍照，并隨機選取5個不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析綠色和紅色熒光強度，并以綠色與紅色熒光強度的比值評價MMP（比值越大，則表示細胞MMP越高）。

2.8 H9c2心肌細胞中ATP酶活性的測定

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，以胰蛋白酶消化;收集細胞至10 mL離心管中，以1 500 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀以PBS洗滌2次;加入生理鹽水5 mL，于冰浴條件下，采用超聲破碎儀破碎細胞（功率為300 W，頻率為40 kHz，每隔4 s超聲1次）;經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，取適量蛋白，按相應試劑盒說明書方法操作，測定細胞中ATP酶（包括Na+-K+ -ATP酶和Ca2+-Mg2+- ATP酶）的活性。

2.9 H9c2心肌細胞中Cyto c蛋白、RISK信號通路相關蛋白及HIF-1α蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項下方法分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，以PBS洗滌2次;加入胰酶1 mL消化2 min后，加入完全培養(yǎng)基終止消化;以1 000 r/min離心3 min，棄上清液，收集沉淀，按照細胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒說明書方法操作，提取細胞質(zhì)和線粒體中的蛋白，備用。另外，按上述方法對H9c2心肌細胞分組（每組設3個復孔）、造模和給藥處理后，以預冷的PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液（含1% PMSF）冰浴裂解細胞5 min，于4 ℃以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液，得細胞總蛋白，備用。取線粒體蛋白、細胞質(zhì)蛋白、總蛋白適量，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度;蛋白經(jīng)變性后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加入5%BSA溶液封閉2 h，然后分別加入Cyto c、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、HIF-1α、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），室溫孵育2 h;以TBST洗滌5 min×5次，加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 8 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜5 min×5次后，加入ECL顯色，并于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像。采用Quantity One 4.6軟件進行分析，以Cyto c在細胞質(zhì)中灰度值與在線粒體中灰度值的比值表示線粒體膜的開放程度（比值越大，則表示線粒體膜開放程度越大）;以p-Akt與Akt、p-ERK1/2與ERK1/2的灰度值的比值分別表示Akt、ERK1/2的磷酸化水平;以HIF-1α與內(nèi)參β-? ?actin的灰度值的比值表示其表達水平。

2.10 加入抑制劑后H9c2心肌細胞中RISK信號通路相關蛋白表達水平的檢測

將H9c2心肌細胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，然后分為正常對照組、模型組、葒草花提取物組（80 μg/mL，濃度根據(jù)前期研究設置）、LY+? ?CoCl2組（15 μmol/L LY+800 μmol/L CoCl2）、LY+葒草花提取物組（15 μmol/L LY+80 μg/mL葒草花提取物）、PD+CoCl2組（25 μmol/L PD+800 μmol/L CoCl2）、PD+葒草花提取物組（25 μmol/L PD+80 μg/mL葒草花提取物），每組設3個復孔。其中，LY和PD給藥濃度根據(jù)文獻[18-20]設置。除正常對照組、模型組、葒草花提取物組外，其余各組細胞均在造模前加入相應抑制劑預處理20 min，然后再按“2.3”項下方法造模與給藥。分組培養(yǎng)完畢后，按“2.9”項下方法提取細胞總蛋白并檢測加入抑制劑后RISK信號通路相關蛋白的表達情況。

2.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞凋亡的影響

正常對照組細胞形態(tài)正常、核染色均勻;模型組細胞核固縮、致密濃染，可見大量凋亡小體;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細胞核固縮現(xiàn)象減輕，凋亡小體數(shù)量減少，詳見圖1。

3.2 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中ROS水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中ROS水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細胞中ROS水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表1。

3.3 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中鈣離子水平（細胞質(zhì)中）的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中鈣離子水平（細胞質(zhì)中）顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物中、高濃度組細胞中鈣離子水平（細胞質(zhì)中）顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表1。

3.4 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞MMP水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞MMP水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細胞MMP水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表1。

3.5 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中ATP酶活性的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物中、高濃度組細胞中上述酶活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.6 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞的細胞質(zhì)和線粒體中Cyto c蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞的細胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花水提物各濃度組細胞中上述指標比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表3。

3.7 葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中RISK信號通路相關蛋白及HIF-1α蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.01），HIF- 1α蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），HIF-1α蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），詳見圖6、表3。

3.8 加入抑制劑后葒草花提取物對缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中RISK信號通路相關蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物組細胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與葒草花提取物組比較，LY+葒草花提取物組細胞中Akt蛋白磷酸化水平和PD+葒草花提取物組細胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖7、表4。

4 討論

CoCl2是一種模擬缺氧條件的化學試劑，常被用來制備細胞缺血缺氧損傷模型[21]。在本課題組前期研究的基礎上[3]，本研究采用800 μmol/L CoCl2復制H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷模型。在體內(nèi)外的細胞缺氧復氧損傷過程中，細胞內(nèi)的氧化應激和鈣離子誘導的線粒體功能障礙驅(qū)動了細胞的損傷和凋亡[21-23]，其中ROS是氧化應激中破壞機體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的主要根源[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細胞的細胞核固縮、致密濃染，可見大量凋亡小體;細胞中ROS水平顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預后，細胞中ROS水平顯著降低。這表明葒草花提取物可通過提高細胞清除ROS的能力，從而發(fā)揮抗缺氧復氧損傷的作用。

ATP酶是存在于生物膜上的一種蛋白酶，具有物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等生物學功能;機體在缺氧刺激下，心肌細胞會迅速由有氧代謝轉(zhuǎn)為無氧糖酵解，使細胞中ATP耗竭，進一步引起一系列的代謝紊亂和異常，從而使得依靠ATP轉(zhuǎn)運的相關ATP酶活性降低，進而導致細胞內(nèi)外離子交換出現(xiàn)異常，引起細胞內(nèi)鈣離子超載[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細胞中Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低，鈣離子水平（細胞質(zhì)中）顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預后，上述ATP酶活性顯著升高，鈣離子水平（細胞質(zhì)中）顯著降低。這表明葒草花提取物可通過提高ATP酶活性，維持心肌細胞中正常的物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等生物學功能，從而逆轉(zhuǎn)心肌細胞中鈣離子水平的升高，最終發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開會導致膜電位去極化、釋放凋亡因子和降低氧化磷酸化水平[26]，因此測定MMP可評價線粒體的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細胞MMP顯著升高，經(jīng)葒草花提取物干預后，細胞MMP顯著降低，這表明葒草花提取物可通過保護線粒體，改善H9c2心肌細胞的缺血缺氧損傷。

相關研究發(fā)現(xiàn)，當線粒體的功能失調(diào)時，可釋放Cyto c進入細胞質(zhì)，激活級聯(lián)凋亡反應[9]，進而激活線粒體的重構(gòu)[6]，最終導致細胞的凋亡和壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細胞的細胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預后，上述指標比值顯著降低。這表明葒草花提取物可通過降低缺血缺氧損傷H9c2心肌細胞線粒體膜的開放程度，改善其缺氧復氧損傷。

RISK信號通路是機體對抗心肌缺血再灌注的最重要的通路之一[27]。當心肌細胞受到缺氧復氧刺激時，多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)會依賴于RISK途徑發(fā)揮保護細胞的作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葒草花提取物干預后，缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中Akt蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平均顯著升高;使用Akt蛋白和ERK蛋白的抑制劑分別處理后，細胞中Akt蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平均顯著降低，說明葒草花提取物對Akt蛋白和ERK蛋白的激活作用被阻斷，證實了其可能是通過RISK信號通路對缺氧復氧損傷的心肌細胞發(fā)揮保護作用。

當HIF-1α在機體常氧條件下保持穩(wěn)定水平時，具有保護心肌缺血再灌注的作用，但是，當其過度表達時，可能會導致心臟損傷[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復氧損傷H9c2心肌細胞中HIF-1α的蛋白表達水平顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預后，細胞中HIF-1α蛋白表達水平顯著降低。這表明葒草花提取物可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白表達，從而發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

綜上所述，葒草花提取物可改善H9c2心肌細胞的缺氧復氧損傷，其作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡、提高ATP酶活性、保護線粒體、調(diào)節(jié)RISK信號通路相關蛋白和HIF-1α蛋白表達有關。

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（收稿日期：2021-01-29 修回日期：2021-03-12）

（編輯：唐曉蓮）