4-羥基-苯丙噁唑-2-酮對非酒精性脂肪肝病模型大鼠炎癥和凋亡信號通路的影響

徐萬鵬 林軍 梁英琴 周煥芳 張華 黃仕珍 孫雪梅 韋秀桂 王紅園 劉林

摘 要 目的：探討4-羥基-苯丙噁唑-2-酮對非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）模型大鼠炎癥和凋亡信號通路的影響。方法：將SD大鼠分為正常對照組（10只）和造模組（50只），正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，造模組大鼠給予高脂飼料以復(fù)制NAFLD模型。造模成功后，將大鼠分為正常對照組、模型組、水飛薊賓組（26.25 mg/kg）和4-羥基-苯丙噁唑-2-酮高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），每組8只，正常對照組和模型組大鼠灌胃0.6%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。末次給藥后，檢測大鼠血清中白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）水平，ALB/GLB比值以及游離脂肪酸（FFA）水平;采用TUNEL染色法觀察大鼠肝細(xì)胞凋亡情況;采用Western blot法檢測大鼠肝組織中炎癥信號通路相關(guān)蛋白[Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白（IκBα）]的表達(dá)水平或磷酸化水平以及凋亡信號通路相關(guān)蛋白[B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）]的表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，4-羥基-苯丙噁唑-2-酮各劑量組大鼠血清中TP（低劑量組除外）、GLB、FFA水平和肝組織中TLR4（低劑量組除外）、MyD88（中劑量組除外）、caspase-3蛋白表達(dá)水平以及NF-κB p65、IκBα的磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清中ALB/GLB比值和肝組織中Bcl-2/Bax比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01），肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象有所改善。結(jié)論：4-羥基-苯丙噁唑-2-酮可改善大鼠NAFLD狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與抑制肝組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 4-羥基-苯丙噁唑-2-酮;非酒精性脂肪肝病;炎癥;凋亡;TLR4/MyD88/NF-κB信號通路;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of 4-hydroxy-2（3H）-benzoxazolone on inflammatory and apoptosis signaling pathways in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） model rats. METHODS： SD rats were divided into normal control group （10 rats） and modeling group （50 rats）. Normal control group was given basic diet， and modeling group were given high-fat diet to induce NAFLD model. After modeling， the rats were divided into normal control group， model group， silibinin group （26.25 mg/kg）， and 4-hydroxy-2（3H）-benzoxazolone high-dose， medium-dose and low-dose groups （100， 50， 25 mg/kg）， with 8 rats in each group. Normal control group and modeling group were given 0.6% CMC-Na intragastrically， and other groups were given relevant medicine 10 mL/kg intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After last medication， the serum levels of albumin （ALB）， total protein （TP）， globulin （GLB）， ALB/GLB and free fatty acid （FFA） were detected; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of rat hepatocytes. Western blot assay was used to detect the protein expression and phosphorylation level of inflammatory signaling pathway related proteins [Toll-like receptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， nuclear factor-κB p65 （NF-κB p65）， NF-κB inhibitor protein （IκBα）] in liver tissue as well as the expression of apoptosis signaling pathway related proteins [B cell lymphoma 2（Bcl-2）， Bax， caspase-3]. RESULTS： Compared with model group， serum levels of TP （except for low-dose group）， GLB and FFA， the protein expression of TLR4 （except for low-dose group）， MyD88 （except for medium-dose group） and caspase-3， the phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα protein were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The ratio of ALB/GLB in serum and the ratio of Bcl-2/Bax in liver tissue were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and the phenomenon of hepatocyte apoptosis was improved. CONCLUSIONS： 4-hydroxy-2（3H）-benzoxazolone can ameliorate NAFLD in rats， and the mechanism may be associated with inhibiting the expression TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway-related proteins and apoptosis-related proteins in liver tissues.

KEYWORDS? ?4-hydroxy-2（3H）-benzoxazolone; Non-alcoholic fatty liver disease; Inflammation; Apoptosis; TLR4/MyD88/NF-? κB signaling pathway; Rats

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活節(jié)奏和飲食方式也發(fā)生了變化，發(fā)生肥胖的人數(shù)越來越多，而肥胖人群也更容易患非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[1-2]。NAFLD是由肝中脂質(zhì)代謝失衡引起、超過5%肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性的疾病，若不進(jìn)行相應(yīng)治療，NAFLD可發(fā)展為肝硬化或肝癌[3-4]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜并伴隨其他代謝系統(tǒng)的疾病，目前在臨床上尚無特效治療藥物[5-6]。因此，積極開發(fā)新型的天然藥物來緩解該疾病的發(fā)生發(fā)展，已成為當(dāng)今肝病領(lǐng)域研究的熱點。

Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）是典型的炎癥信號通路。有研究指出，抑制該通路活化可減少中性粒細(xì)胞等炎癥介質(zhì)的釋放，從而改善肝損傷[7-8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）和抑凋亡蛋白Bcl-2在NAFLD進(jìn)展中扮演著不可替代的角色[9-10]。由此推測，可通過抑制炎癥和凋亡這兩條信號通路，來改善NAFLD。

老鼠簕Acanthus ilicifolius L.為爵床科老鼠簕屬的灌木植物，常年生長在潮間帶、亞熱帶、海岸帶和熱帶地區(qū)，是紅樹林植物群落中的重要品種之一，主要含有黃酮、多糖和萜類等活性成分，具有一定的藥用價值[11-12]。本課題組前期從老鼠簕生物堿中分離出了單體化合物4-羥基-苯并噁唑-2-酮，經(jīng)動物實驗證明其對小鼠急、慢性肝損傷和大鼠肝纖維化均有較好的改善作用[13-14]，但其是否可改善NAFLD尚不明確。鑒于此，本研究擬通過高脂飲食喂養(yǎng)大鼠以誘導(dǎo)建立NAFLD模型，以水飛薊賓為陽性對照藥[15]，研究4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠炎癥和凋亡信號通路的影響，以期為該化合物的后續(xù)開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：BS-2000型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），Nanodrop2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher? ?Scientific公司），SpectraMaxPlus384型酶標(biāo)儀（香港分子儀器有限公司），BX53型顯微鏡（日本Olympus公司），Micro CL17R型高速低溫離心機(jī)（德國Thermoiec公司），OdysseyClx型雙色紅外熒光成像儀（美國Licor公司），EM20-7-10型電泳儀、SWB-20L-1型恒溫?fù)u床（美國Major Science公司），RM2255型自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：4-羥基-苯并噁唑-2-酮（廣西醫(yī)科大學(xué)藥化合成實驗室，純度>99%），水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號950701001，規(guī)格35 mg），白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司，批號分別為140918006、140818007），游離脂肪酸（FFA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20190826），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號031819190506），RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號20200903），PVDF膜（美國Millipore公司，批號R0JB89871），兔源TLR4多克隆抗體、鼠源Bcl-2單克隆抗體、鼠源Bax單克隆抗體（美國Proteintech公司，批號分別為19811-1-AP、60178-1-Ig、60267-2-Ig），兔源MyD88多克隆抗體、兔源磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、兔源NF-κB p65多克隆抗體、兔源磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗體、兔源IκBα單克隆抗體、兔源caspase-3多克隆抗體、兔源β-actin多克隆抗體（美國CST公司，批號分別為4283S、3033S、8242S、2859T、4812S、9662S、4970S），熒光標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Licor公司，批號D00804-07），熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（美國Invitrogen公司，批號Tl268740）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物與飼料

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量114～138 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（桂）2014-0002。大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房間溫度為21～25 ℃、濕度為40%～60%、每日光照明暗交替，大鼠自由飲水和攝食。高脂飼料購自北京博愛港生物技術(shù)有限公司，基礎(chǔ)飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時間后，隨機(jī)分為正常對照組（10只）、造模組（50只），正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，造模組大鼠給予高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)8周后，分別挑選1、3只大鼠進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，當(dāng)造模組大鼠出現(xiàn)顯著的肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪空泡時，表明NAFLD造模成功[16]。將造模成功的大鼠分為模型組、水飛薊賓組（陽性對照，26.25 mg/kg，劑量參考文獻(xiàn)[15]設(shè)置）和4-羥基-苯并噁唑-2-酮高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg，劑量參考課題組前期研究結(jié)果設(shè)置[17]），每組8只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時以0.6%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑），正常對照組與模型組大鼠灌胃等體積溶劑，灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 標(biāo)本收集

各組大鼠給藥結(jié)束后禁食、不禁水，于次日上午稱其體質(zhì)量，然后腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，以真空采血管收集全血，靜置1 h后，以3 500 r/min離心15 min，收集上層血清，備用。取血后，快速剖取大鼠肝組織，以生理鹽水洗去其表面的血跡，以吸水紙吸干后，于肝大葉相同地方切取約1 cm3的肝組織，固定于10%甲醛溶液中，備用;剩余的肝組織分裝到1.5 mL離心管中，進(jìn)行后續(xù)檢測。

2.3 大鼠血清中ALB、TP、GLB和FFA水平檢測

取“2.2”項下血清樣品，采用全自動生化檢測儀進(jìn)行分析，檢測各組大鼠血清中肝功能指標(biāo)（ALB、TP、GLB）水平，并計算ALB/GLB比值。另外，參照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，測定各組大鼠血清中脂質(zhì)代謝指標(biāo)FFA水平。

2.4 大鼠肝細(xì)胞凋亡情況觀察

取“2.2”項下固定于10%甲醛溶液中的肝組織，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋處理后，切片（4 ?m）并貼附于防脫載玻片上，待烘干后，依次置于二甲苯、無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇中進(jìn)行脫蠟、脫水;再將切片按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書方法操作后，置于顯微鏡下觀察，切片中出現(xiàn)的棕褐色斑點即為凋亡細(xì)胞。

2.5 大鼠肝組織中TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平或磷酸化檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.2”項下各組大鼠肝組織適量，加入RIPA裂解液和液氮進(jìn)行研磨，提取肝組織中的蛋白質(zhì)，然后于4 °C條件下以12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用蛋白分析儀測定其蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，取適量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜;以TBST清洗5 min×3次，放入封閉液中室溫孵育1 h;以TBST清洗5 min×3次，加入TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、caspase-3、Bcl-2、Bax一抗（除Bax一抗稀釋度為1 ∶ 6 000、Bcl-2一抗稀釋度為1 ∶ 2 000外，其余抗體的稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;次日以TBST清洗5 min×3次，加入相對應(yīng)的二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），于室溫在搖床上孵育1 h;再以TBST清洗5 min×3次，采用Odyssey Clx型雙色紅外熒光成像儀進(jìn)行掃描，并保留圖片。采用Image J 2×軟件對圖片進(jìn)行分析，以p-NF-κB p65蛋白與NF-κB p65蛋白灰度值的比值、p-IκBα蛋白與IκBα蛋白灰度值的比值分別表示NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平;以Bcl-2蛋白與Bax蛋白灰度值的比值表示凋亡水平;以TLR4、MyD88、caspase-3蛋白灰度值分別與內(nèi)參（β-actin）蛋白灰度值的比值表示其表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠血清中肝功能指標(biāo)水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TP、GLB水平均顯著升高（P<0.01），ALB/GLB比值顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊賓組和4-羥基-苯并噁唑-2-酮各劑量組大鼠血清中TP（低劑量組除外）、GLB水平均顯著降低，ALB/GLB比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠血清中FFA水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中FFA水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊賓組和4-羥基-苯并噁唑-2-酮各劑量組大鼠血清中FFA水平均顯著降低（P<0.01），詳見表1。

3.3 4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

顯微鏡下可見，正常對照組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)微量棕褐色斑點，肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較輕;模型組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)大量棕褐色斑點，較為密集，肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象嚴(yán)重;水飛薊賓組和4-羥基-苯并噁唑-2-酮各劑量組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)少量棕褐色斑點，肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象相較于模型組有所改善，詳見圖1。

3.4 4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠肝組織中TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中TLR4、MyD88、caspase-3蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊賓膠囊組和4-羥基-苯并噁唑-2-酮各劑量組大鼠肝組織中TLR4（低劑量組除外）、MyD88（中劑量組除外）、caspase-3蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），Bcl-2/Bax比值均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表2。

4 討論

NAFLD是代謝綜合征定位在肝中的一種表現(xiàn)，目前研究者認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、炎癥和凋亡等因素有關(guān)[18-19]。肝在儲存肝糖原、分泌膽汁、去氧化、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)合成中扮演著關(guān)鍵性角色，是人體重要的代謝功能器官[20]。一旦肝發(fā)生病變，則會影響蛋白質(zhì)合成與分解代謝平衡，從而引起血清中TP、ALB、GLB水平發(fā)生變化，ALB/GLB比值降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，成功造模后，大鼠血清中TP、GLB水平顯著升高，ALB/GLB比值顯著降低;經(jīng)4-羥基-苯并噁唑-2-酮干預(yù)后，大鼠血清中TP、GLB水平顯著降低，ALB/GLB比值顯著升高，表明4-羥基-苯并噁唑-2-酮對NAFLD模型大鼠的肝損傷有一定改善作用。

另有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗的發(fā)生能減弱胰島素對激素敏感性脂肪酶的抑制效應(yīng)，加快外周脂肪組織的分解速率，增加FFA水平;當(dāng)肝中FFA水平遠(yuǎn)超過其在線粒體中氧化消耗的量時，則會引起肝脂質(zhì)的堆積，從而造成肝細(xì)胞一系列的損傷[22-23]。線粒體在氧化消耗FFA的過程中會生成過多的活性氧，從而觸發(fā)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、炎癥等反應(yīng)以及肝細(xì)胞的凋亡;另外，未消耗的FFA還能誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，進(jìn)一步加重對肝的損傷[24]。因此，F(xiàn)FA代謝失衡是NAFLD的典型特征表現(xiàn)，并始終貫穿著NAFLD的發(fā)生與發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中FFA水平顯著升高;經(jīng)4-羥基-苯并噁唑-2-酮干預(yù)后，大鼠血清中FFA水平顯著降低，表明4-羥基-苯并噁唑-2-酮對大鼠NAFLD狀態(tài)下的代謝失衡有一定調(diào)控作用。

TLR4是炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)受體之一，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性時，可激活TLR4的一系列級聯(lián)信號傳導(dǎo)，進(jìn)而觸發(fā)MyD88的聚集，導(dǎo)致MyD88依賴性的信號傳導(dǎo)通路被激活[7-8]。MyD88作為一種信號適配器分子，可引起下游信號通路中NF-κB二聚體與抑制因子IκB的分離;解離后的IκB可快速磷酸化，從而推動NF- κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)κB結(jié)合位點，使NF-κB信號通路得以活化，進(jìn)而調(diào)控多種炎癥介質(zhì)的合成與分泌，加重肝損傷的發(fā)展[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中TLR4、MyD88蛋白表達(dá)水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高;經(jīng)4-羥基-苯并噁唑-2-酮干預(yù)后，大鼠肝組織中上述指標(biāo)均顯著改善，表明4-羥基-苯并噁唑-2-酮可通過調(diào)控炎癥信號通路從而改善大鼠NAFLD狀態(tài)。

Bcl-2是一類保守的家族蛋白，其家族成員在涉及肝細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著主導(dǎo)性影響，并伴隨NAFLD的整個致病過程[26-27]。另有研究顯示，caspase家族蛋白作為細(xì)胞凋亡信息的重要運(yùn)輸者，在細(xì)胞凋亡過程中居于關(guān)鍵地位;其中，caspase-3蛋白不僅是細(xì)胞凋亡信號的執(zhí)行者，也是發(fā)揮凋亡效應(yīng)的主要因子，其可啟動初期的細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠成功造模后，其肝組織中Bcl-2/Bax比值顯著降低，caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高;經(jīng)4-羥基-苯并噁唑-2-酮干預(yù)后，大鼠肝組織中Bcl-2/Bax比值顯著升高，caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明4-羥基-苯并噁唑-2-酮可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)從而改善大鼠的NAFLD狀態(tài)。

綜上所述，4-羥基-苯丙噁唑-2-酮可改善大鼠NAFLD，其機(jī)制可能與抑制肝組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-01-09 修回日期：2021-03-27）

（編輯：唐曉蓮）