骨瘤康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉秋艷 段佩利 金燕飛 張海波

【摘 要】 目的：建立骨瘤康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對骨瘤康顆粒中的熟地黃、白芍、川芎進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定骨瘤康顆粒中的芍藥苷含量。結(jié)果：熟地黃、 白芍、川芎的薄層色譜鑒別主斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，分離度良好，陰性無干擾;含量測定芍藥苷在20～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系 ，r=0.9996（n=6），平均加樣回收率96.74%，RSD為1.48%（n=6）。結(jié)論：所建立的骨瘤康顆粒薄層色譜定性鑒別方法以及含量測定方法準(zhǔn)確可行、重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，能夠有效對該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 骨瘤康顆粒;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);高效液相色譜法;含量測定;芍藥苷

【中圖分類號】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）09-0053-05

Abstract：Objective To establish the quality standard of guliukang granules. Methods Radix rehmanniae， Radix Paeoniae Alba and Rhizoma Chuanxiong in guliukang granules were identified by TLC. The content of paeoniflorin in Gu liu kang granules was determined by HPLC. Results The results showed that the main spots of Radix rehmanniae， Radix Paeoniae Alba and Rhizoma Chuanxiong were clear， with strong specificity， good resolution and negative interference; the content determination of paeoniflorin showed a good linear relationship with the peak area in the concentration range of 20～200ug / mL， r=0.9996 （n=6）， the average recovery was 96.74%， RSD was 1.48% （n=6）. Conclusion The established TLC qualitative identification method and content determination method of guliukang granules are accurate， feasible， reproducible and specific， which can effectively control the quality of guliukang granules.

Keywords：[JP4]Gu Liu Kang Granules; Quality Standard; High-Performanceli-Quid Chromatography; Content Determination; Paeoniflorin

骨瘤康顆粒為國家級名中醫(yī)王祥麒教授臨床用于治療腎精虧虛型骨轉(zhuǎn)移癌的經(jīng)驗方，處方由白芍、熟地黃、山慈菇、白芥子、川芎、皂角刺等十二味中藥組成，具有補(bǔ)腎填精、柔肝止痛、化痰散結(jié)的功效 [1-2]。 骨瘤康顆粒臨床以湯劑入藥，味苦量大，服用不便，故將其研制成顆粒劑[3-5]。為控制制劑質(zhì)量，本研究參照文獻(xiàn)[6-14 ] 采用薄層色譜法對方中熟地黃、川芎、白芍三味中藥進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法對骨瘤康顆粒中芍藥苷含量進(jìn)行測定，從而保證制劑的安全性及有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000 高效液相色譜儀-紫外檢測器（美國賽默飛世爾科技公司）;Good Look-1000型全自動薄層色譜成像系統(tǒng)（上海科哲生化科技有限公司）; ? EYELA N-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （日本 Rikakikai 公司）; HK250型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)臺式超聲波清洗器）;硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥 骨瘤康顆粒三批中試樣品（批號20190407、20190413、20190422 ），芍藥苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為：X27F8C30162，含量≥98%） ;熟地黃對照藥材 （中國藥品生物制品檢定所）、川芎對照藥材（中國藥品生物制品檢定所）、乙腈、磷酸（ 色譜純，天津四友）;水為超純水（自制）;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 熟地黃薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒10 g， 加水50 mL， 加熱至沸，放冷，離心，上清液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對照藥材4 g，加水60 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。另取缺熟地黃的陰性對照，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液。置日光與紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品無干擾。如圖1、圖2所示。

2.1.2 白芍薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒 2.0 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液;取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另取缺白芍的陰性對照品2.0 g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶[KG-*3/5]5∶10∶[KG-*3/5]0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在l05℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性無干擾。如圖3所示。

2.1.3 川芎薄層色譜鑒別 取骨瘤康顆粒 2.0 g，加乙醚20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典》四部通則0502]試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn) 。陰性無干擾。如圖4所示。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗 ? ?以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶[KG-*3/5]86）為流動相;檢測波長為230 nm。

2.2.2 溶液制備 對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取骨瘤康樣品2 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液：按樣品處方比例及工藝制備不含白芍的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液

2.2.3 專屬性試驗 分別吸取對照品溶液，供試品溶液以及陰性對照品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣。供試品與對照品在相應(yīng)位置處出現(xiàn)相同色譜峰，陰性對照在對照品峰相應(yīng)的位置上無干擾，說明專屬性良好。如圖5所示。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取濃度為200 μg/mL的對照品儲備液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于10 mL量瓶中，用甲醇溶液配成濃度為10、20、40、80、120、160、200 μg/mL的對照品溶液，搖勻，分別吸取上述對照品溶液10μL進(jìn)樣，按設(shè)定色譜條件測定，濃度μg/mL為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程： y=0.246x-0.2458，r=0.9996，實(shí)驗結(jié)果見表1及圖6。試驗結(jié)果表明，芍藥苷在 20～200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取上述對照品溶液（濃度：60 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明：RSD為1.41%，表明使用該測定方法儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h各測定峰面積（A）1次，結(jié)果見表3。試驗結(jié)果表明：RSD為0.64% ?，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗 取同一批樣品6份，按供試品溶液制備并測定，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明，RSD為0.45%，樣品重復(fù)性較好。

2.2.8 回收率試驗 精密量取已知含量同一批號的樣品1 mL，置50 mL量瓶中，平行取樣6份，精密加入濃度為60 μg/mL的對照品溶液0.45 mL、0.75 mL、1.05 mL各兩份，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液 ? ，依法測定，計算回收率，RSD值，結(jié)果見表5。

由以上結(jié)果得出平均加樣回收率96.74%， RSD為 1.48%。說明此方法準(zhǔn)確可行。

2.2.9 樣品含量測定 取骨瘤康顆粒3批中試產(chǎn)品樣品每批2份。按2.2.2制備方法制得供試品溶液及對照品溶液，按照2.2.1項下色譜條件對不同批次樣品進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計算芍藥苷含量，結(jié)果見表6。

由以上得出：三批骨瘤康顆粒樣品芍藥苷的含量在1.8541～2.0616 mg/g， 考慮到藥材的差異性，以及不同批次轉(zhuǎn)移率的不同，再加上樣品批次較少， 按最低含量下浮30%制訂骨瘤康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中芍藥苷含量[11]， 暫定骨瘤康顆粒中芍藥苷含量不少于1.30 mg/g。

3 討論

骨瘤康顆粒組方從“腎主骨生髓”的理論出發(fā)，以補(bǔ)腎為根本。方中熟地黃補(bǔ)腎填精，白芍柔肝止痛，二藥共為君藥。但熟地黃2015年版《中國藥典》規(guī)定其指標(biāo)性成分為毛蕊花糖苷， 在含量檢測指標(biāo)篩選時，預(yù)實(shí)驗過程中首先對熟地黃中所含指標(biāo)性成分毛蕊花糖苷進(jìn)行HPLC含量檢測方法研究。采用多種方法對其進(jìn)行檢測，供試品色譜中無相應(yīng)峰。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，毛蕊花糖苷不穩(wěn)定 [15]，在長時間加熱過程中易發(fā)生美拉登反應(yīng)，因此無法作為含量控制指標(biāo)[16-18]。 2015年版《中國藥典》規(guī)定白芍的指標(biāo)性成分為芍藥苷。實(shí)驗首先對制劑中熟地黃、白芍、川芎、山慈菇、白芥子等中藥進(jìn)行薄層色譜定性鑒別研究。查閱文獻(xiàn)山慈菇暫未收載其薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)。白芥子薄層色譜鑒別陰性干擾嚴(yán)重，無法作為定性鑒別項。熟地黃、川芎、白芍薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，陰性無干擾，故將熟地黃、川芎、白芍作為該制劑的定性控制指標(biāo)。

實(shí)驗對白芍的指標(biāo)性成分芍藥苷進(jìn)行HPLC含量檢測，在20～200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.9996（n=6），平均加樣回收率96.74%，RSD為1.48%（n=6）。其方法專屬性好、精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能較好控制主藥指標(biāo)成分含量?？勺鳛楣橇隹殿w粒的含量測定。

因此，利用薄層色譜法對骨瘤康顆粒中熟地黃、川芎、白芍三味中藥進(jìn)行定性鑒別，其斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng);使用HPLC法對骨瘤康顆粒中的芍藥苷進(jìn)行含量測定，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶[KG-*3/5]86）為流動相;檢測波長為230 nm，其線性方程為 y=0.246x-0.2458，r=0.9996，平均加樣回收率96.74%，RSD為1.48%（n=6）。 3批制劑中芍藥苷平均含量分別為1.9577，RSD值為3.76%。因此本實(shí)驗所建立的熟地黃、川芎、白芍TCL鑒別方法及芍藥苷含量測定方法準(zhǔn)確易行，精密度、穩(wěn)定、重復(fù)性均較好，能有效控制骨瘤康顆粒制劑質(zhì)量。

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（收稿日期：2020-10-16 編輯：程鵬飛）