廣西柑橘碎葉病和葉斑病調(diào)查及其病原的遺傳多樣性分析

張金珠 鄒承武 黃俊源 鄧崇嶺 陳保善 張木清

摘 ?要：調(diào)查了廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州及防城港等主要柑橘種植區(qū)的柑橘碎葉病和葉斑病的發(fā)生情況，并對其病原柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus， CTLV）、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus， ASGV）和柑橘葉斑病毒（Citrus leaf blotch virus， CLBV）進(jìn)行了RT-PCR檢測、病毒序列測定和遺傳多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有疑似柑橘病毒病樣品中，CTLV檢出率為7.3%，CLBV檢出率為5.5%，ASGV檢出率為3.0%。其中在南寧、桂林和玉林3個主要柑橘種植區(qū)采集的疑似柑橘病毒病樣品的3種病毒病檢出率合計分別為21.2%、28.6%和7.6%，且存在多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。將克隆到的上述3個病毒分離物的病毒片段，分別與已報道的相應(yīng)病毒的代表性分離物的病毒片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，ASGV和CTLV的中國分離物在進(jìn)化關(guān)系上均呈寄主相關(guān)性，ASGV的日本分離物則與地理位置相關(guān)性更強，而韓國和印度的分離物未表現(xiàn)出明顯的寄主相關(guān)性和地理位置相關(guān)性。柑橘和蘋果的ASGV和CTLV分離物均表現(xiàn)與地理位置相關(guān)，而梨的ASGV和CTLV分離物卻與地理位置和寄主均不相關(guān);CLBV分離物則呈明顯的寄主相關(guān)性。本研究首次報道了廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的發(fā)生情況及其病原的遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為柑橘病毒病的診斷和防治提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柑橘;病毒病調(diào)查;病毒檢測;遺傳多樣性分析

中圖分類號：S436.661.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： The occurrence of citrus tatter leaf disease and citrus leaf spot disease were investigated in the main planting areas of citrus in Nanning， Chongzuo， Liuzhou， Guilin， Yulin， Hechi， Hezhou， and Fangchenggang of Guangxi. RT-PCR detection， viral genome sequencing and genetic diversity analysis were carried out for the pathogenic viruses， including Citrus tatter leaf virus （CTLV）， Apple stem grooving virus （ASGV）， and Citrus leaf blotch virus （CLBV）. The results showed that the detection rates of CTLV， ASGV， and CLBV in suspected viral samples collected from the ci-trus-producing areas in Nanning， Guilin， and Yulin was 21.2%， 28.6%， and 7.6%， respectively. Additionally， the mixed infection of multiple viruses was detected. Among the samples tested， the detection rate of CTLV was the highest （7.3%）， followed by CLBV （5.5%）， and ASGV （3.0%）. The genetic diversity analysis and phylogenetic analysis were carried out by comparing the sequences of the three virus isolates cloned in this study with those of several repre-sentative viruses reported. The results demonstrated that both ASGV and CTLV isolates in China presented host correlation in the evolutionary relationship， while ASGV isolates in Japan showed a stronger association with geographical location. Still， the strains in South Korea and India did not show significant host or geographical location correlation. The isolates of ASGV and CTLV on citrus and apple presented a relationship with geographic location， while their isolates on pear showed no association with geographic location or host. Moreover， all strains of CLBV showed a distinct relationship with the host. It is the first time to report the occurrence of citrus tatter leaf disease and citrus leaf spot disease in Guangxi and the genetic diversity of their pathogenic viruses， which would provide a reference for the diagnosis and control of citrus virus diseases.

Keywords： citrus; viral disease investigation; virus detection; analysis of genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.030

近年來廣西柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，種植面積和產(chǎn)量均居全國首位。但是生產(chǎn)上大量使用嫁接苗，容易導(dǎo)致柑橘病毒病流行，嚴(yán)重威脅柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。已報道的廣西柑橘病毒病的病原主要有柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus， CTLV）[2-4]、柑橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus， CYVCV）[5]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）[6]、柑橘裂皮?。–itrus exocortis viroid， CEV）[7]、溫州蜜柑萎縮病（Satsuma dwarf virus， SVD）[8]等。柑橘碎葉病的病原有2種，分別是CTLV和蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus， ASGV）[9]，其中最早于1908年在加利福尼亞的“邁耶”檸檬上發(fā)現(xiàn)了CTLV[4]。CTLV屬于β線性病毒科（Beta fexiviridae）、發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的正義單鏈RNA病毒，大小為600～700 nm×15 nm，呈線性彎曲狀[10]。CTLV易于機械傳播，尚無通過介體傳播的證據(jù)。該病毒在我國浙江、廣東、廣西、福建、臺灣及湖南等地均有發(fā)現(xiàn)，在澳大利亞、南非和美國等國家也有發(fā)現(xiàn)[11]。該病毒對以枳及枳的雜種為砧木的柑橘樹危害最大。感染特征為枳砧嫁接口腫大，結(jié)合處不親和，截面呈黃褐色，易斷裂，葉脈黃化，葉片易脫落，植株矮化等，嚴(yán)重時整株枯死。CTLV的外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列的進(jìn)化關(guān)系與宿主和地理來源均無明顯相關(guān)性[9]。ASGV是β線性病毒科發(fā)狀病毒屬的代表種，其病毒粒子長為620～680 nm，直徑為12 nm的彎曲線狀[12]。ASGV在世界各地均普遍存在，是果樹上一種重要的潛在病毒，該病毒寄主范圍廣泛，侵染率高，可以侵染蘋果、梨、柑橘等果樹。ASGV在蘋果植株上的為害癥狀不明顯[13-14]，但對植株生長、果實產(chǎn)量和品質(zhì)等造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致產(chǎn)量下降[15]。Hilf等[16]用ASGV抗體在柑橘碎葉病樣品中檢測到ASGV，其CP基因序列的同源性與宿主及地理位置無顯著相關(guān)性[17-18]。柑橘葉斑病毒（Citrus leaf blotch virus， CLBV）是近年來國內(nèi)新報道的一種柑橘病毒[19]，該病毒屬于β線性病毒科柑橘病毒屬（Citrivirus）的正義單鏈RNA病毒，其病毒粒子為絲狀顆粒，大小約為960 nm× 14 nm[20]。目前中國對該病毒的報道較少，在自然條件下，CLBV主要侵染柑橘屬（Citrus L.）和獼猴桃屬（Actinidia L.）[21]。近年來，發(fā)現(xiàn)CLBV可侵染柑橘[22]、檸檬[13]、獼猴桃[23]、櫻桃[24]、芍藥[25]、煙草[26-27]等植物。CLBV主要通過嫁接感染的方式進(jìn)行傳播，獼猴桃感染初期癥狀不明顯，后期葉片表現(xiàn)為不規(guī)則褪綠癥狀，且發(fā)病葉片小于健康葉片[28]。在美國加利福尼亞首次發(fā)現(xiàn)該病毒可引起橘橙（‘Dweet tangor， Citrus tangerine×C. sinensis）葉片出現(xiàn)黃色斑駁，隨后在西班牙發(fā)現(xiàn)金橘（Fortunella margarita）也可感染該病毒。CLBV在我國重慶、湖南、浙江、四川、湖北、云南均有報道，在廣西尚無該病毒的報道。項周等[29]通過分析15個CLBV分離物的CP基因部分序列，結(jié)果顯示CLBV分離物分組不明顯，與其寄主及地理來源無明顯相關(guān)性。

近年來，廣西柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是由于部分種植區(qū)田間管理不規(guī)范，病毒病日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致果品及產(chǎn)量逐年下降。對廣西多個柑橘種植區(qū)的柑橘碎葉病和葉斑病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集疑似病毒病樣品進(jìn)行病原分子鑒定和遺傳多樣性分析，將初步明確廣西柑橘碎葉病和葉斑病發(fā)生情況及其病原的遺傳多樣性，為進(jìn)一步研究和防治柑橘病毒病奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?田間調(diào)查及采樣

2018年12月至2019年11月，對廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州及防城港等8個主要柑橘種植區(qū)的不同品種進(jìn)行柑橘病毒病調(diào)查。根據(jù)植株嫁接口腫大、葉片偏小且邊緣不規(guī)則、葉片皺縮、葉脈變黃等表觀特征，采集疑似病毒病樣品，以及少量無癥狀樣品，樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?柑橘葉片總RNA的提取 ?剪取50～100 mg柑橘葉片樣品，置于備有2顆無菌鋼珠的2 mL RNase free離心管中，使用研磨儀研成粉末狀，用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后取1 μL純化的總RNA樣品，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測提取的總RNA質(zhì)量，剩余RNA樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 ?引物合成 ?CTLV和ASGV同屬于發(fā)狀病毒屬（Capillovirus），具有高度同源性。本研究使用檢測引物ASGV-U/ASGV-2[30]對所采集疑似樣品進(jìn)行CTLV和ASGV檢測，根據(jù)文獻(xiàn)報道的CLBV檢測引物CLBV-1F/CLBV-5R[31]對所采集疑似樣品進(jìn)行CLBV檢測（表1）。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 ?RT-PCR擴增 ?以柑橘葉片總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：4×gDNA wiper Mix 4 μL，RNA模板1 μL，RNase-free ddH2O 11 μL，瞬時離心，42 ℃水浴2 min;再加5×Hiscript III qRT Super Mix 4 μL，瞬時離心。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃保存。所得cDNA稀釋1倍，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，分別使用CLBV、ASGV檢測引物CLBV1F/5R和ASGV-U/-2對cDNA進(jìn)行PCR擴增。在干凈的PCR管中，加入2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL;上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL;已稀釋的cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 ℃，3 min;變性94 ℃，15 s;退火56 ℃，15 s;延伸72 ℃，15 s;35個循環(huán);72 ℃徹底延伸5 min;于4 ℃保存。

1.2.4 ?RT-PCR產(chǎn)物電泳及測序 ?取5 μL的擴增產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中，于1.5%瓊脂糖凝膠（含GoldView I型核酸染色劑）中以120 V、20 min，檢測其完整性，用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。目的條帶清晰明亮的片段采用PCR產(chǎn)物直接測序法，目的條帶較暗淡的片段采用PCR產(chǎn)物純化法，提高產(chǎn)物濃度。本研究所有陽性樣品的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行正反鏈雙向測序，對目標(biāo)片段內(nèi)正反向序列完全吻合的序列加以采用。所得核酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST程序（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進(jìn)行比對分析。

1.2.5 ?CTLV、ASGV和CLBV基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析 ?為了分析CTLV、ASGV和CLBV基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，首先從GenBank基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中分別檢索了所有與ASGV、CTLV和CLBV相關(guān)的序列，然后分別選擇具有代表性的ASGV、CTLV和CLBV分離物的CP基因序列，分別與本研究獲得的ASGV、CTLV和CLBV分離株的CP基因序列通過ClustalW程序與默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對分析（表2）。序列對齊后，分別在序列的5和3端裁掉不對應(yīng)的部分堿基以及刪去本研究中一致性較高的序列，利用MEGA 7.0.26軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，校檢次數(shù)（bootstrap）為1000次。再根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析各分離物的寄主和地理位置的相關(guān)性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的調(diào)查

2018年12月至2019年11月，在廣西南寧、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、賀州、及防城港等8個主要柑橘種植區(qū)調(diào)查柑橘病毒病的發(fā)生情況，共采集了165個樣品，其中沃柑82個、青柚23個、砂糖橘30個、甜橙7個、早熟溫州柑7個、貢柑7個、茂谷柑5個、蜜柚4個。調(diào)查結(jié)果顯示，在玉林市的調(diào)查點只發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病，發(fā)病率為0%～7.7%;在桂林市的調(diào)查點發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病和柑橘碎葉病，發(fā)病率為3.8%;南寧市調(diào)查點也發(fā)現(xiàn)柑橘葉斑病和柑橘碎葉病，且發(fā)病率最高，為4.2%～11.7%;其中發(fā)病最嚴(yán)重的區(qū)域是南寧市邕寧區(qū)百濟(jì)鎮(zhèn)壇里祝柑果園，發(fā)病率高達(dá)73%;在柳州、賀州、河池、崇左和防城港的調(diào)查點未發(fā)現(xiàn)柑橘病毒病。本研究檢測到感染CTLV的柑橘葉片表現(xiàn)為黃脈、葉片黃化、葉片不規(guī)則等癥狀。檢測到感染ASGV、CTLV、CLBV的植株均有嫁接口不親和、腫大的共同特征（圖1A1）。檢測到感染ASGV的植株葉片表現(xiàn)為褪綠、葉小等癥狀;檢測到感染CLBV的柑橘葉片表現(xiàn)為葉片邊緣不規(guī)則;檢測到ASGV和CLBV復(fù)合侵染的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉脈變黃、植株矮化等癥狀;檢測到CLBV和CTLV復(fù)合侵染的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉面有斑點等癥狀（圖1A2）。

2.2 ?RT-PCR檢測CLBV和ASGV

用引物ASGV-U/ASGV-2和CLBV-1F/CLBV- 5R對采集的疑似樣品進(jìn)行RT-PCR檢測。大部分樣品中都擴增出499 bp（ASGV-U/ASGV-2）和425 bp（CLBV-1F/ CLBV-5R）左右的特異目的條帶，而健康葉片和陰性對照無目標(biāo)條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示利用引物ASGV-U/ASGV-2擴增獲得的序列與GenBank上的ASGV和CTLV序列具有高度相似性，在93.07%～99.31%之間;而引物CLBV-1F/CLBV-5R擴增獲得的序列與GenBank上的CLBV序列相似性高達(dá)98.06%～99.86%。

2.3 ?廣西柑橘碎葉病和柑橘葉斑病的病原病毒種類及分布

田間病害調(diào)查時共采集165份葉片樣品，包括有癥狀和無癥狀的植株樣品，其中檢測出26個樣品含有CTLV、ASGV和CLBV（表3）。在南寧市（邕寧區(qū)、馬山縣、園博園、武鳴區(qū)）和桂林市采集的12個樣品上檢測到CTLV病毒，檢出率為7.3%;在南寧市（邕寧區(qū)和上林縣）和桂林市采集的5個樣品上檢測到ASGV病毒，檢出率為3.0%;在南寧市（邕寧區(qū)）和玉林市采集的9個樣品上檢測到CLBV，檢出率為5.5%;此外，發(fā)現(xiàn)一些樣品存在2種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，CTLV和ASGV復(fù)合侵染的樣品有3份，占1.8%;CTLV和CLBV復(fù)合感染的樣品2份，占1.2%;ASGV和CLBV復(fù)合侵染的樣品1份，占0.6%。廣西各地的柑橘病毒檢出種類不同，檢出率差異較大。南寧和桂林是廣西的柑橘主要產(chǎn)區(qū)，病毒病發(fā)病率較高。南寧地區(qū)的病毒病發(fā)生情況也比較復(fù)雜，3種病毒均檢出，其中ASGV 4份，占4.2%，CTLV 11份，占11.7%，CLBV 5份，占5.3%。桂林的26份樣品檢測出CTLV和ASGV各1份。玉林的柑橘葉斑病檢出率較高，14份樣品中有4份檢測為陽性，占28.6%（表3）。這3種病毒病目前在南寧、桂林和玉林的柑橘種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，其他地區(qū)的樣品未檢出，但仍需引起重視。

2.4 ?CTLV和ASGV分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析

由于ASGV和CTLV的序列高度同源，將本研究獲得的ASGV基因組序列（表2）與NCBI的GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，可從中檢索出所有的ASGV和CTLV序列，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4），結(jié)果表明，CTLV的寄主以柑橘類為主，而ASGV的寄主則以蘋果和梨為主，獼猴桃次之。并且CTLV和ASGV分離物主要來源于中國。為了揭示系統(tǒng)發(fā)育之間的關(guān)系，基于ASGV和CTLV基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對病毒分離物按不同地理來源和不同寄主來源進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，ASGV、CTLV與宿主種類或地理來源均有一定關(guān)系。

2.4.1 ?地理位置分析 ?從地理位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，來源于中國的ASGV和CTLV主要以柑橘、蘋果、梨、獼猴桃4種寄主為主（圖3A），并按寄主類型聚類共聚為8組，分別命名為A、B、C、D、E、F、G、H組。聚類分支為A組的分離物全部來源于柑橘，包括來自湖南、重慶、廣東、廣西、臺灣等?。▍^(qū)）和本研究獲得的1個來源于廣西的分離物（MS-1）;聚類分支為B組的分離物均來源于武漢的梨;C組分為2個副組，部分來源于重慶、四川、湖北的柑橘聚為C1副組，部分來源于武漢獼猴桃的病毒為C2副組;D組和E組的分離物均來自湖北的梨;F組來源于湖南和臺灣的柑橘分離物;G組來源于吉林蘋果的分離物;H組大部分是本研究來自廣西柑橘上的分離物，只有1個是來源于遼寧蘋果上的分離物（A1）。因此，在中國的ASGV和CTLV 2種病毒與地域分布顯著相關(guān)。ASGV在韓國主要寄生在梨和蘋果植株上，沒有檢索到與CTLV相關(guān)的序列，也沒有明顯的寄主聚類支（圖3B），但分別聚為5組，分別命名為A、B、C、D、E組。分支為A組的ASGV分離物均來自蘋果;B組的分離物有蘋果和梨;ASGV-SGS是來源于梨的分離物，單獨聚為C組;本研究分離物MS-1與韓國蘋果的分離物A211和梨的分離物KP2聚為D組;本研究所獲得的其他3個CTLV分離物和1個ASGV分離物全部聚在E組。在日本，ASGV和CTLV主要寄生在柑橘上，按地理位置聚為2組（圖3C），分別命名為A、B組。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，來源于日本柑橘上的ASGV和CTLV分離物聚為A組，本研究的ASGV和CTLV分離物聚為B組。值得一提的是，本研究的分離物MS-1與日本柑橘分離物聚為一組，其余7個分離物聚為另一組。從印度的系統(tǒng)發(fā)育分析來看，印度未檢索到CTLV相關(guān)分離物，檢測到的病毒以ASGV為主。ASGV的寄主有蘋果、獼猴桃、梨、柑橘等，但沒有寄主相關(guān)性，主要聚類為2個組（圖3D），分別命名為A、B組。其中A組又聚為A1、A2、A3三個副組，A1、A3均為印度分離物，而A2為本研究的中國廣西分離物。本研究的5個分離物分為2組，分離物MS-1既不與廣西分離物聚類，也不與印度分離物聚類，本地所有分離物與印度分離物不相關(guān)，包括較特異的MS-1。

2.4.2 ?寄主相關(guān)性分析 ?從寄主相關(guān)性角度進(jìn)行

分析，發(fā)現(xiàn)以柑橘為寄主的大多為CTLV，而ASGV較少，以印度分離物為主，中國和日本分離物只有少數(shù)，經(jīng)NCBI檢索同樣可以證明這一點。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，將基因型分為4個聚類（圖4A），Ⅰ組由14個成員組成，其中大部分來自中國臺灣和重慶的分離物，但本研究的MS-1與它們聚類在一組。由于在本研究中所評估的基因序列在聚類中表現(xiàn)出較大差異，因此它們的類群劃分并無明確界限。有8個分離物聚為Ⅱ組，Ⅱ組又細(xì)分為3個亞組。Ⅱ組最明顯的亞群為Ⅱ1，是來自中國的分離物（BJNM、YHC-1、SXH-1），Ⅱ2的2個CTLV分離物（Meyer lemon、TL110）來自美國，3個來自印度的ASGV分離物聚類在Ⅱ3，在Ⅱ組中明顯按地理位置聚類。因此，柑橘寄主上的CTLV和ASGV與地理位置具有一定相關(guān)性。來自中國重慶的2個分離物和來自中國廣西的2個分離物聚類在Ⅲ組，由于它們的遺傳距離較為相似，廣西的2個病毒分離物有可能是在重慶引種時隨著接穗帶到廣西。剩下的6個本地分離物（MS-4、XD-D、WM-7、SL-8、ZG-4、ZG-11）聚類在Ⅳ組。這6個樣品來自廣西5個不同的地點，CTLV分離物MS-4是馬山縣果園采集的樣品，CXD-D是來自桂林的樹苗移栽至廣西大學(xué)的樣品，WM-7樣品采自武鳴區(qū);ASGV分離物SL-8來自上林縣，ZG-4和ZG-11樣品采自邕寧區(qū)祝柑果園，南寧市區(qū)內(nèi)的3個分離物聚為1個分支，上林和桂林的分離物聚為另一個分支，在廣西同樣具有一定地理位置關(guān)系。以上6個分離物均采自沃柑，而沃柑是廣西的主要柑橘品種，ASGV和CTLV 2種病毒已經(jīng)開始危害廣西的柑橘產(chǎn)業(yè)，因此，應(yīng)該重視這2種病害，加強檢疫，減少該病毒對柑橘的危害。利用本研究的11個分離物序列分別對來自中國、韓國和印度等國家的24個梨分離物和28個蘋果分離物進(jìn)行基因系統(tǒng)樹分析（圖4B，圖4C）。這些基因聚類為幾個主要組別，而且本研究基因序列與NCBI檢索的基因明顯分開，以蘋果為寄主的主要聚類為4個組群（圖4B），Ⅰ組主要是6個中國分離物和4個印度分離物，以及1個韓國分離物，還包括1個本地的柑橘分離物MS-1。MS-1與韓國蘋果分離物K211聚為1個分支，本地CTLV柑橘分離物MS-1很有可能來源于韓國。9個韓國分離物和1個巴西分離物以及2個印度分離物聚類為Ⅱ組，巴西的分離物為一個分支，印度分離物單獨一個分支，來自同一地理位置的分離物聚為一個分支，呈現(xiàn)出地理位置相關(guān)性。Ⅲ組由印度分離物和巴西分離物組成，各自又單獨為一個分支，具有地理位置相關(guān)性。由本地柑橘的8個分離物與1個遼寧分離物（A1）聚類為Ⅳ組。以梨為寄主的呈現(xiàn)2個分歧很大的分支（圖4C），所有分離物聚為2個組，其中本研究的10個分離物聚為Ⅱ組，本研究的其余1個分離物MS-1與NCBI數(shù)據(jù)庫檢索的24個分離物聚為Ⅰ組，并且MS-1與韓國梨分離物KP2聚在一個分支?？偟膩碚f，不管是蘋果還是梨，所有的組群都是由不同地區(qū)的ASGV組成，值得注意的是，本研究的分離物MS-1既與來自韓國蘋果分離物K211聚類，又與韓國梨分離物KP2聚類。再次表明本地CTLV柑橘分離物MS-1可能來源于韓國，并且與寄主種類無相關(guān)性。

2.5 ?CLBV分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究共獲得9個柑橘葉斑病毒分離物的CP基因序列，序列登錄號見表2，基于CLBV部分CP基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5），主要聚為3組（A、B、C），A組主要是前期報道來自中國（8個）、新西蘭（2個）以及韓國（1個）的分離物。其中，中國分離物包括本地柑橘的4個分離物，這些分離物來自不同的柑橘種植區(qū)，ZG-10和ZG-7采自南寧祝柑果園的樣品，YBY-10采自園博園，而BB-8采自玉林。源于中國的獼猴桃分離物HZ、F1-N、F-HY聚為B組，再次證明了CLBV的遺傳進(jìn)化與寄主有關(guān)。而中國櫻桃分離物（Prunus）單獨聚在C組，表明該組群在某種程度上與CLBV的寄主呈一定相關(guān)性。

3 ?討論

柑橘碎葉病是普遍發(fā)生的一種柑橘病毒病，在全球主要柑橘種植區(qū)均有報道，其中在中國CTLV為害較嚴(yán)重。據(jù)報道，ASGV和CTLV都可通過嫁接傳播[32-33]。用于嫁接的枝條或砧木帶毒，以及嫁接工具未消毒是導(dǎo)致ASGV和CTLV傳播的重要因素[34-35]。本研究對采自廣西8個柑橘主要種植區(qū)的165份葉片樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3.0%的樣品檢出ASGV，7.3%的樣品檢出CTLV，5.5%的樣品檢出CLBV（表3）。與項周等[29]調(diào)查中國7個省的CLBV和CTLV檢出率（9.6%、11.0%）相比，廣西柑橘碎葉病和葉斑病的檢出率略低。癥狀相同的植株攜帶的病毒種類可能不同，如南寧的ZG-2、ZG-7樣品植株表觀癥狀同為嫁接口腫大、葉片黃化偏小且邊緣不規(guī)則，ZG-2檢測到ASGV和CLBV，而ZG-7檢測到CTLV和CLBV。廣西柑橘病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍存在，同時檢測到ASGV和CLBV的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉脈變黃、植株矮化等癥狀;同時檢測到CLBV和CTLV的植株表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、葉面有斑點等癥狀;且未表現(xiàn)癥狀的植株樣品也可能檢測到病毒的存在。因此，在柑橘種苗繁殖過程中，開展病毒早期診斷極為重要，應(yīng)在柑橘健康種苗的培育和生產(chǎn)中加強病毒檢測，加強專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)，規(guī)范嫁接過程，減少病毒感染和傳播的機會。本研究首次在廣西南寧、玉林的柑橘樣品中檢測到CLBV，是近年來國內(nèi)新報道的一種柑橘病毒[19]。2017年項周等[29]首次報道該病毒在湖北、江西、四川和云南等省份的柑橘上發(fā)生。CTLV與CLBV屬于不同病毒科，它們在受到復(fù)合侵染的柑橘植株中的關(guān)系如何，其共同侵染是否會在致病過程中產(chǎn)生協(xié)同作用，均值得進(jìn)一步研究。

為了比較來自世界各地的基因組序列與中國廣西分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，按不同寄主和不同地理來源分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4）。結(jié)果表明，ASGV和CTLV與宿主或地理起源均呈一定相關(guān)性。經(jīng)Blast結(jié)果證實，發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）的CTLV與ASGV 2個分離株密切相關(guān)。姬盼等[36]在云南蘋果上ASGV的研究表明，分子變異與寄主或地域來源存在一定的相關(guān)性。本研究從地理位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖3A～圖3D），ASGV和CTLV在中國與寄主呈遺傳相關(guān)性，這與Liebenberg等[37]研究發(fā)現(xiàn)ASGV的多樣性與寄主存在一定相關(guān)性的結(jié)論一致。據(jù)報道，ASGV在西洋梨上的遺傳進(jìn)化也揭示了與寄主具有相關(guān)性[38]。在日本分離物的進(jìn)化樹中2種病毒的遺傳關(guān)系呈現(xiàn)出與地理區(qū)域有關(guān)，這一結(jié)論在本領(lǐng)域研究甚少。在韓國和印度都未檢索到CTLV，ASGV的遺傳關(guān)系也與寄主無關(guān)。從寄主上進(jìn)行分析，根據(jù)所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)（圖4a～圖4c），以柑橘為寄主的CTLV和ASGV沒有明顯分組，但亞組中明顯按地理位置聚類;在蘋果寄主上的Ⅱ組和Ⅲ組有一定的地理位置相關(guān)性，但不顯著;這一結(jié)論與李正男等[17]在沙果上ASGV全基因組的分析一致。在寄主梨上既無地理位置相關(guān)性也無寄主相關(guān)性，鄭銀英等[18]通過分析ASGV的CP基因序列也表明其遺傳關(guān)系與寄主及地理來源無明顯相關(guān)性。綜上分析，與來自不同寄主和不同國家無關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育簇可能是無性繁殖、國家間種質(zhì)交換以及繁殖材料長距離運輸或是一棵樹上多次嫁接所導(dǎo)致的。本研究的分離物MS-1不與其他本地分離物聚類而與韓國、日本分離物聚類，可能是在進(jìn)行種質(zhì)交換時，病毒通過引進(jìn)種苗傳播到廣西。而其他本地分離物始終聚在一起，與不同寄主、不同來源的分離物都具有較遠(yuǎn)的遺傳距離，說明本地砧木可能存在感染病毒的風(fēng)險。因此，在引進(jìn)柑橘品種過程中，不僅只檢疫柑橘苗木，而且要對砧木進(jìn)行檢疫。

本研究對廣西不同地理來源的柑橘植株上的CLBV分離物進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，該病毒遺傳變異很小，這與Vives等[39]報道的結(jié)論一致，這表明該組群在某種程度上與CLBV的寄主呈一定相關(guān)性。本研究的CLBV系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，廣西柑橘上CLBV的CP基因核苷酸序列與來源不同寄主的基因序列具有明顯的寄主相關(guān)性。Chavan等[31]在獼猴桃基因組分析得出CLBV與其寄主來源有關(guān)。有研究表明，CLBV主要的傳播途徑包括無性繁殖材料和種苗運輸過程[40]，還可通過種子侵染柑橘[41]。因此，為了防止該病毒擴散，應(yīng)加強對種苗及繁殖材料的檢疫。目前有關(guān)這3種病毒的遺傳多樣性及其在中國柑橘上的危害特性研究相對缺乏，本研究分離了17個柑橘病毒基因序列，可為柑橘病毒遺傳多樣性研究提供更加豐富的病毒基因信息，同時，為后續(xù)病毒重組事件分析提供基因數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，以此獲得更全面的病毒基因遺傳情況，解析病毒的遺傳變異。

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