A型肉毒梭菌培養(yǎng)基中植物水解蛋白替代胰酪蛋白胨的可行性分析

王云天，陳蘇玲，苗承輝，陸儉，李晨昊，何星

蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司毒素制劑室，甘肅蘭州730046

肉毒梭菌是一種能形成芽胞的革蘭陽性厭氧菌，可產(chǎn)生A~G 7種不同的神經(jīng)毒素［1］。A型肉毒毒素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和美容行業(yè)［2］，其原理是A型肉毒毒素阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)的乙酰膽堿受體，導(dǎo)致神經(jīng)信號不能傳導(dǎo)而引起肌肉松弛［3-4］。蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的注射用A型肉毒毒素（商品名：衡力?）是我國批準(zhǔn)上市，以治療和美容為目的的唯一國內(nèi)產(chǎn)品［5］，是由產(chǎn)毒較高的A型肉毒梭菌Hall株經(jīng)產(chǎn)毒培養(yǎng)、純化等一系列生產(chǎn)過程制備，在產(chǎn)毒培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源是用動(dòng)物源性的胰酪蛋白胨提供的。為避免在A型肉毒毒素產(chǎn)品中引入其他外源性病毒的隱患，考慮用植物水解蛋白（tryptonesubstitute，TS）替代。TS是非動(dòng)物源性（aminalorigin free，AOF）氮源，與胰酪蛋白胨相比，其相對分子質(zhì)量較小，易于被細(xì)菌生長所吸收，且其碳水化合物總量較高，能在細(xì)菌生長后期提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)來源［6］，是動(dòng)物源性有機(jī)氮源的可能替代物。本文對以TS作為主要成分的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的A型肉毒梭菌的產(chǎn)毒力以及生產(chǎn)的收獲物進(jìn)行研究，分析TS替代胰酪蛋白胨的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株 A型肉毒梭菌Hall株由美國威斯康辛大學(xué)食品研究所1984年惠贈(zèng)，現(xiàn)保存于蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司菌種庫。

1.2 培養(yǎng)基 TYG（胰酪蛋白胨-酵母浸出粉-葡萄糖）培養(yǎng)基由蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司毒素制劑室2015年制備，批號分別為20150101、20150302、20150403、20150504、20150605、20150906、20151007。

1.3 主要試劑及儀器 胰酪蛋白胨和酵母浸出粉購自英國OXOID公司；葡萄糖購自山東祥瑞藥業(yè)有限公司；TS購自美國UNITED STATESBIOLOGICAL公司；Thermo6000系列培養(yǎng)箱購自美國THERMO公司；HI123臺(tái)式酸度測定儀購自美國漢娜公司；UV-1206型分光光度計(jì)購自日本島津公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及毒力測定方法 SPF級昆明小鼠，雌性，26~30日齡，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（甘2012-0001）。培養(yǎng)基產(chǎn)毒力測定方法是采用尾靜脈注射的方法（Broff法）［7］，用IV（intravenous injection）毒力表示；收獲物檢定時(shí)毒力測定方法是采用腹腔注射的方法［7］，用IP（intraperitoneal injection）毒力表示。

1.5 收獲物檢定方法 吸光度比值：樣品在260和280 nm波長處的吸光度的比值（A260／A280）；蛋白濃度：A280／1.66［8］；純度：IP毒力 ／蛋白濃度；蛋白質(zhì)圖譜：SDS-PAGE法（4%~12%梯度膠）檢測結(jié)晶毒素的蛋白組成［7］。

1.6 培養(yǎng)基T S濃度的篩選試驗(yàn)

1.6.1 產(chǎn)毒力篩選試驗(yàn) 其他成分濃度不變，分別配制TS濃度為3%、4%、5%、6%、7%的培養(yǎng)基于血漿瓶中，250 mL／瓶，115℃，30 min滅菌處理后，接種A型肉毒梭菌，于35℃培養(yǎng)120 h，測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力是否≥1×105LD50／mL（A型肉毒梭菌產(chǎn)毒力內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)）［7］。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 純化篩選試驗(yàn) 按1.6.1項(xiàng)結(jié)果選擇培養(yǎng)基產(chǎn)毒力平均值最高的3種TS濃度，培養(yǎng)基其他成分濃度不變，分別配制3種TS濃度的培養(yǎng)基，各1瓶，9 000 mL／瓶，115℃，30 min滅菌處理后，接種A型肉毒梭菌，于35℃培養(yǎng)120 h。測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力后，采用注射用A型肉毒毒素的生產(chǎn)工藝對培養(yǎng)液進(jìn)行純化，對比純化結(jié)果，篩選出適合生產(chǎn)工藝的TS濃度。

1.7 T S YG（植物水解蛋白-酵母浸出粉-葡萄糖）培養(yǎng)基放大培養(yǎng)試驗(yàn)

1.7.1 正常生產(chǎn)規(guī)模的產(chǎn)毒力試驗(yàn) 選擇1.6.2項(xiàng)篩選的最佳TS濃度制備3批培養(yǎng)基，批號分別為試20150101、試20150502和試20151103，每批培養(yǎng)基總量為27 000 mL，分裝于立瓶，9 000 mL／瓶，共3瓶，115℃，30 min滅菌處理后，接種A型肉毒梭菌，于35℃培養(yǎng)120 h。測定培養(yǎng)液產(chǎn)毒力，確認(rèn)放大至生產(chǎn)規(guī)模后產(chǎn)毒力是否 ≥1×105LD50／mL，并與TYG培養(yǎng)基的產(chǎn)毒力效果進(jìn)行比較。

1.7.2 TSYG培養(yǎng)基收獲物檢定 用3批（試2015-0101、試20150502和試20151103）TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物，采用注射用A型肉毒毒素的生產(chǎn)工藝。收獲物對應(yīng)批號為試H-20150101、試H-20150502和試H-20151103。檢測收獲物的質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率、IP毒力、吸光度比值、純度和蛋白質(zhì)圖譜是否符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.8 T S YG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)的對比 對3批（試20150101、試20150502和試20151103）TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物（對應(yīng)批號分別為試H-20150101、試H-20150502、試H-2015-1103）及7批（20150101、20150302、20150403、20150-504、20150605、20150906、20151007）TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物（對應(yīng)批號分別為H-20150101、H-2015-0302、H-20150403、H-20150504、H-20150605、H-201-50906、H-20151007），進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率和純度的分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，成組t檢驗(yàn)方法分析不同培養(yǎng)基的產(chǎn)毒力以及收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)結(jié)晶毒素收率和純度，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基T S濃度的篩選

2.1.1 產(chǎn)毒力篩選 TS濃度為3%、4%、5%、6%、7%的培養(yǎng)液，IV毒力均≥1×105LD50／mL，符合培養(yǎng)基產(chǎn)毒力要求，見表1。選擇產(chǎn)毒力結(jié)果平均值較高的3%、4%和5%3個(gè)TS濃度進(jìn)行下一步純化篩選。

表1 產(chǎn)毒力篩選試驗(yàn)結(jié)果（×105 LD50／mL）Tab.1 Screening of toxigenic capacity（×105 LD50／mL）

2.1.2 純化篩選 3種TS濃度的培養(yǎng)液IV毒力均≥1×105LD50／mL，TS濃度5%的培養(yǎng)液IV毒力為9.80×105LD50／mL，高于另外2種濃度。純化過程中，TS濃度3%的培養(yǎng)液在提取-離心階段固液未分，導(dǎo)致純化不能繼續(xù)，廢棄；TS濃度4%和5%的培養(yǎng)液純化結(jié)果均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。TS濃度5%的培養(yǎng)液產(chǎn)毒力及純化的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)（純度和蛋白收率）均優(yōu)于TS濃度4%的培養(yǎng)液，因此選擇5%作為放大培養(yǎng)的TS濃度。見表2。

表2 不同TS濃度培養(yǎng)液純化結(jié)果Tab.2 Purification of toxin produced by culture medium at various TSconcentrations

2.2 T S YG培養(yǎng)基放大培養(yǎng) 3批放大至正常生產(chǎn)量的TSYG培養(yǎng)基，經(jīng)產(chǎn)毒培養(yǎng)后，IV毒力均≥1×105LD50／mL，符合培養(yǎng)基產(chǎn)毒力質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。TSYG培養(yǎng)基與TYG培養(yǎng)基產(chǎn)毒力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.529，P=0.615），見表3，表明TSYG培養(yǎng)基的產(chǎn)毒效果不低于TYG培養(yǎng)基。

表3 TSYG培養(yǎng)基與TYG培養(yǎng)基產(chǎn)毒力對比Tab.3 Comparison of toxigenic capacities of TSYGand TYGculture media

2.3 T S YG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的檢定結(jié)果 3批TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的結(jié)晶毒素收率均在0.8~7.0 mg／L之間，吸光度比值均 ＜0.60，IP毒力均 ＞1.00×106LD50／mL，純度均 ＞1.00×107LD50／mg，均符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；在非還原和還原條件下電泳圖譜均與參考品一致。見表4和圖1。3批TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的檢定結(jié)果全部符合要求。

圖1 結(jié)晶毒素SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of crystal toxin

表4 TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果Tab.4 Quality indexes of toxin produced by TSYG medium

2.4 T S YG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)對比結(jié)果 TSYG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的結(jié)晶毒素收率、純度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.424和-1.513，P分別為0.178和0.154），見表5。表明TSYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物質(zhì)量并不低于TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物。

表5 TSYG與TYG培養(yǎng)基生產(chǎn)的收獲物的關(guān)鍵參數(shù)對比Tab.5 Comparison of main parameters of toxin produced by TSYGand TYGculture media

3 討論

在A型肉毒梭菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的作用是為細(xì)菌生長提供充足的營養(yǎng)。對注射用A型肉毒毒素制品而言，不但需要培養(yǎng)基產(chǎn)毒力符合要求，而且殘留物也不能對純化產(chǎn)生影響，能夠用現(xiàn)有工藝生產(chǎn)出符合要求的結(jié)晶毒素。

本研究用TS配制的培養(yǎng)基接種肉毒梭菌后，在培養(yǎng)過程中，細(xì)菌生長良好，產(chǎn)氣旺盛，產(chǎn)毒力符合《中國藥典》三部（2015版）［7］規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，與胰酪蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)A型肉毒梭菌相比無差異性。

原液檢定的重要指標(biāo)是純度及蛋白含量，純度決定了成品中A型肉毒毒素的實(shí)際蛋白含量，人體使用純度不高的產(chǎn)品會(huì)導(dǎo)致抗體產(chǎn)生，而原液的純度也得益于培養(yǎng)收獲物中的毒素含量和純度。雖然目前沒有文獻(xiàn)證明A型肉毒毒素制品注射到人體內(nèi)有抗體產(chǎn)生，但為了降低風(fēng)險(xiǎn)，蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)原液所選用的培養(yǎng)收獲物毒素含量均在3.0×107LD50／mg以上，本次實(shí)驗(yàn)中批號為試H-20150502的收獲物純度為3.79×107LD50／mg，完全符合生產(chǎn)原液的標(biāo)準(zhǔn)。

3批TSYG培養(yǎng)液經(jīng)現(xiàn)有工藝純化，純化過程各項(xiàng)參數(shù)與現(xiàn)行生產(chǎn)工藝基本無差異，其收獲物的檢定結(jié)果也均符合《中國藥典》三部（2015版）［7］規(guī)定的A型肉毒毒素收獲物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。因此可以確定，用TS替代胰酪蛋白胨是可行的。