新型冠狀病毒滅活疫苗研發(fā)及應(yīng)用

鄧濤，年懸懸，張家友，黃仕和，楊曉明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207；2.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430207；3.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京100029

過(guò)去十幾年，因重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCoV）及中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）感染引起的呼吸道傳染病的流行，使冠狀病毒成為21世紀(jì)新的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。2019年12月，中國(guó)武漢報(bào)告了一種伴隨不明原因發(fā)熱的呼吸道疾病病例，隨后通過(guò)病毒分離鑒定為一種由新型冠狀病毒引起的肺炎［2］。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將該病毒命名為重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），世界衛(wèi)生組織（WHO）將其引起的疾病命名為新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）［3］。COVID-19已演變?yōu)槿虼罅餍?，截?021年5月30日，全球已有超過(guò)1.69億的確診病例和超過(guò)351.91萬(wàn)的死亡病例［4］。接種疫苗是預(yù)防控制COVID-19大流行最有效的措施之一。滅活疫苗一直是疫苗的重要研發(fā)方向，已被廣泛用于狂犬病、流感、脊髓灰質(zhì)炎、霍亂等疾病的預(yù)防。目前，全球范圍內(nèi)至少有9種COVID-19全病毒滅活疫苗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其中武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱(chēng)武漢生物）、北京生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱(chēng)北京生物）及北京科興生物制品有限公司（簡(jiǎn)稱(chēng)科興生物）的3種COVID-19滅活疫苗已在多個(gè)國(guó)家授權(quán)使用［5-6］。

本文對(duì)SARS-CoV-2的特征以及COVID-19滅活疫苗研發(fā)的毒種與細(xì)胞基質(zhì)選擇、生產(chǎn)工藝、臨床前與臨床研究、對(duì)突變株的保護(hù)作用和未來(lái)面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 SARS-CoV-2的特征

冠狀病毒為單股、正鏈RNA病毒，具有球形包膜，直徑為100~160 nm［7］，可感染蝙蝠、豬、貓、嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)等多個(gè)物種［8］。與人類(lèi)相關(guān)的冠狀病毒有7種：HCoV-NL63、HCoV229E、HCoV-OC43、HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2，其中前4種僅引起輕度的上呼吸道癥狀，而后3種是引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的高致病性冠狀病毒［7］。SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV均屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，具有極高的致病性和傳染性。SARS-CoV-2和SARS-CoV與幾種蝙蝠冠狀病毒密切相關(guān)［9］，在COVID-19疫情早期階段，從5名患者身上獲得的全基因組序列與SARS-CoV序列相似性為79.6%［2］。盡管遺傳證據(jù)表明，SARS-CoV-2是一種可能起源于動(dòng)物的自然病毒，但目前尚不清楚這種病毒首次感染人類(lèi)的時(shí)間及地點(diǎn)［10］。SARSCoV-2基因編碼的蛋白包括S、M、E白和N蛋白4種主要結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白的同源三聚體構(gòu)成病毒表面的棘突，在病毒的附著、融合和侵入中起關(guān)鍵作用，也是目前開(kāi)發(fā)疫苗及治療的靶點(diǎn)［11］。此外，研究表明，SARS-CoV-2 S蛋白的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE2）受體的結(jié)合能力比SARS-CoV高10~20倍，這可能使SARS-CoV-2比SARS-CoV具有更高的傳染性［12］。與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2的傳播速度似乎更快［13］，且不斷發(fā)現(xiàn)新的傳染性更強(qiáng)的病毒突變株，COVID-19的預(yù)防控制顯然比SARS-CoV和MERSCoV難度更大。

2 疫苗毒種與細(xì)胞基質(zhì)選擇

滅活疫苗研制的首要任務(wù)是篩選毒株。理想情況下，應(yīng)收集不同地區(qū)不同來(lái)源的病毒分離株，比較各種病毒株在遺傳穩(wěn)定性、免疫原性、交叉保護(hù)性以及細(xì)胞中的傳代適應(yīng)性等，從中選擇免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)范圍廣、能穩(wěn)定傳代的毒株用于滅活疫苗生產(chǎn)。WANG等［14］從3名COVID-19住院患者中分離出3株SARS-CoV-2毒株HB02、CQ01和QD01，其中HB02株在Vero細(xì)胞中復(fù)制最為理想，產(chǎn)毒量最高。全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，HB02株與其他毒株具有同源性，主要保護(hù)抗原（S蛋白）同源性為100%，表明其對(duì)各種SARS-CoV-2毒株具有廣泛的保護(hù)作用。因此，北京生物使用HB02株進(jìn)行COVID-19滅活疫苗的生產(chǎn)。武漢生物則選擇從武漢金銀潭醫(yī)院1名肺炎患者支氣管肺泡灌洗液中分離出的SARS-CoV-2原始毒株（WIV04）作為滅活疫苗毒種，并在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行分離培養(yǎng)［15-17］?？婆d生物從11名住院患者（5名來(lái)自中國(guó)，3名來(lái)自意大利，1名來(lái)自瑞士，1名來(lái)自英國(guó)，1名來(lái)自西班牙）支氣管肺泡灌洗液樣本中分離出SARS-CoV-2，并選擇具有良好遺傳穩(wěn)定性的CN2株作為疫苗生產(chǎn)毒株［18］。印度Bharat Biotech公司從COVID-19患者分離出包含D614G突變的病毒株NIV-2020-770用于研發(fā)滅活疫苗［19-20］。

其次，選擇易感、穩(wěn)定傳代、高效增殖及具有遺傳穩(wěn)定性的細(xì)胞基質(zhì)也是研發(fā)滅活疫苗的關(guān)鍵因素。常用于病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)有雞胚成纖維細(xì)胞、Vero細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、MDCK細(xì)胞及CHO細(xì)胞等。WANG等［21］評(píng)估了常用于分離培養(yǎng)病毒的細(xì)胞系對(duì)SARS-CoV-2的敏感性，發(fā)現(xiàn)猴腎細(xì)胞最敏感，包括來(lái)自于非洲綠猴腎的Vero細(xì)胞系、Vero76細(xì)胞系和BGMK細(xì)胞系，以及來(lái)自恒河猴腎的LLCMK2細(xì)胞系、RhMK細(xì)胞系，但來(lái)自人類(lèi)、狗、貓、鼠和雞的多種細(xì)胞類(lèi)型對(duì)SARS-CoV-2不敏感，同時(shí)最常用于流感病毒研究的MDCK細(xì)胞對(duì)SARS-CoV-2也不敏感。武漢生物、北京生物、科興生物以及印度Bharat Biotech公司等眾多企業(yè)生產(chǎn)的COVID-19滅活疫苗均選擇Vero細(xì)胞作為傳代培養(yǎng)細(xì)胞。WHO已對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行了疫苗生產(chǎn)認(rèn)證［14］。

3 滅活疫苗的生產(chǎn)工藝

全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)工藝一般包括病毒擴(kuò)增、病毒滅活和分離純化3個(gè)主要階段。武漢生物制備COVID-19滅活疫苗的主要步驟包括：使用SARS-CoV-2 WIV04株在Vero細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）出現(xiàn)的第3~4天收集上清液，采用β-丙內(nèi)酯滅活48 h后進(jìn)行澄清、超濾，進(jìn)行第2次β-丙內(nèi)酯滅活后，經(jīng)凝膠層析、離子交換層析、除菌過(guò)濾后加入氫氧化鋁佐劑制備滅活疫苗［15，17］。北京生物通過(guò)將SARSCoV-2 HB02株接種Vero細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲、滅活、澄清、濃縮、純化后，加入氫氧化鋁佐劑制備滅活疫苗［14］。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（簡(jiǎn)稱(chēng)醫(yī)科院生物所）對(duì)收獲的病毒上清液用甲醛進(jìn)行滅活，色譜法進(jìn)行純化濃縮，并使用β-丙內(nèi)酯進(jìn)行二次滅活，再次純化和濃縮制備滅活疫苗［22］。

在過(guò)去幾十年中，已經(jīng)研發(fā)出多種用于疫苗生產(chǎn)的培養(yǎng)工藝，包括轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠(chǎng)及生物反應(yīng)器等培養(yǎng)工藝。目前，大多疫苗生產(chǎn)企業(yè)均采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠(chǎng)培養(yǎng)工藝?；谏锓磻?yīng)器的疫苗生產(chǎn)的主要優(yōu)勢(shì)包括：使用封閉系統(tǒng)，可有效避免污染風(fēng)險(xiǎn)；生產(chǎn)流程及過(guò)程自動(dòng)化程度高，可減少人為操作因素的影響，提高疫苗各批次的一致性和穩(wěn)定性；通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)參數(shù)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒復(fù)制來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量最大化，降低了運(yùn)營(yíng)成本及生產(chǎn)時(shí)間［23］。基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)一般分為微載體、片狀載體及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。北京生物研發(fā)了自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蜂窩交聯(lián)片狀載體，其相同培養(yǎng)體積的細(xì)胞密度較微載體高10余倍，極大提高了COVID-19滅活疫苗的產(chǎn)量［14］。

滅活疫苗的滅活方法包括化學(xué)滅活或物理滅活，前者如β-丙內(nèi)酯、乙烯亞胺和甲醛滅活，后者如γ輻射、紫外光和加熱滅活。這些方法的作用機(jī)制主要是通過(guò)共價(jià)修飾、交聯(lián)、氧化和結(jié)構(gòu)改變對(duì)病原體的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾，使處理的病毒不能感染靶細(xì)胞或在機(jī)體內(nèi)復(fù)制［24］。甲醛和β-丙內(nèi)酯作為最常用的滅活劑，廣泛用于人用滅活疫苗的生產(chǎn)，如對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒等均顯示出較好的滅活效果。烷化劑和雙氧水也可用于病毒滅活［25］，但目前仍處于臨床前研究階段。目前報(bào)道的SARS-CoV-2全病毒滅活疫苗最常見(jiàn)使用 β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活［15，18］，武漢生物和科興生物生產(chǎn)的疫苗還采用了二次β-丙內(nèi)酯滅活策略；醫(yī)科院生物所生產(chǎn)的疫苗先經(jīng)甲醛滅活后，再采用β-丙內(nèi)酯進(jìn)行第2次滅活策略。RAGAN等［24］報(bào)道了一種新的滅活方法來(lái)制備滅活疫苗，即使用核黃素結(jié)合紫外照射來(lái)改變病毒核酸結(jié)構(gòu)，該方法制備的SARS-CoV-2全病毒滅活疫苗在倉(cāng)鼠的攻毒模型中具有保護(hù)作用。與常規(guī)用于滅活疫苗生產(chǎn)的β-丙內(nèi)酯滅活劑不同的是，該方法中使用的核黃素具有良好的安全性，并且沒(méi)有致突變性和致癌性，同時(shí)避免了烷基化、交聯(lián)和共價(jià)修飾［26］。KARAKUS等［27］使用γ射線(xiàn)滅活的SARS-CoV-2疫苗（OZG-3861-01），在BALB／c小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)具有中和能力的抗體產(chǎn)生，并且未觀(guān)察到抗體依賴(lài)增強(qiáng)效應(yīng)（antibody dependent enhancement，ADE）。佐劑的應(yīng)用對(duì)滅活疫苗也非常重要，其能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型，減少抗原用量。目前至少10家企業(yè)計(jì)劃研發(fā)含佐劑的COVID-19疫苗，包括葛蘭素史克公司的AS03、Seqirus公司的MF59和Dynavax公司的CpG 1018［28］，而幾種候選滅活疫苗均選擇較為常用的氫氧化鋁作為佐劑。見(jiàn)表1。

表1 COVID-19候選滅活疫苗制備的比較Tab.1 Preparations of candidate inactivated COVID-19 vaccines

滅活病毒收獲液通常除含有病毒顆粒外，還含有宿主細(xì)胞及殘留蛋白／核酸、培養(yǎng)基成分和引入的外來(lái)物質(zhì)如滅活劑等。如果疫苗制劑中含有雜質(zhì)過(guò)多，則極有可能增加過(guò)敏等不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。因此，在生產(chǎn)滅活疫苗時(shí)需要進(jìn)行純化。滅活疫苗通常采用的純化工藝包括超濾、層析、過(guò)濾等，病毒是否被徹底滅活是生產(chǎn)工藝研究的重點(diǎn)，需對(duì)滅活條件進(jìn)行充分的研究及驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)考慮滅活程序?qū)σ呙缈乖?、效價(jià)等的影響。

4 臨床前研究

疫苗的臨床前研究多基于動(dòng)物模型評(píng)價(jià)免疫原性及安全性。小型動(dòng)物如大鼠、小鼠、家兔和倉(cāng)鼠可用于對(duì)候選疫苗的安全性、免疫原性和劑量進(jìn)行初步評(píng)估，而大型動(dòng)物尤其是非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（nonhuman primates，NHPs）則是評(píng)估疫苗保護(hù)效力的理想模型，其中恒河猴是公認(rèn)為研發(fā)SARS-CoV-2疫苗的理想動(dòng)物模型［30］。幾種候選滅活疫苗的NHPs模型見(jiàn)表2。SARS-CoV和MERS-CoV的中和抗體具有保護(hù)作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV和MERSCoV存在A(yíng)DE現(xiàn)象［31-32］。ADE是一種非中和抗體與病毒結(jié)合，通過(guò)Fcγ受體或補(bǔ)體受體介導(dǎo)的導(dǎo)致疾病增強(qiáng)現(xiàn)象［32-34］。有研究認(rèn)為冠狀病毒的S和N蛋白具有能夠引起ADE的抗原表位，同為冠狀病毒的SARS-CoV-2是否引起ADE也備受關(guān)注［35-36］。臨床前研究的安全性評(píng)價(jià)一般在動(dòng)物模型中進(jìn)行免疫后攻毒試驗(yàn)，檢測(cè)動(dòng)物保護(hù)效力以及有無(wú)抗體介導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)。目前4種類(lèi)型的COVID-19候選疫苗包括滅活疫苗、mRNA疫苗、蛋白亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗的動(dòng)物模型中均未觀(guān)察到明顯的免疫病理?yè)p傷或ADE現(xiàn)象［14-15，18，29，37-43］，見(jiàn)表2。雖然這4種類(lèi)型的候選疫苗在接種和SARS-CoV-2攻擊動(dòng)物的肺中未顯示免疫病理學(xué)變化的證據(jù)，但在人體身上是否產(chǎn)生免疫病例損傷有待進(jìn)一步研究。

表2 COVID-19滅活疫苗的NHPs模型試驗(yàn)比較Tab.2 NHIPs model tests on inactivated COVID-19 vaccine

5 臨床研究

一種新疫苗的研發(fā)周期較長(zhǎng)，需經(jīng)過(guò)臨床前的動(dòng)物試驗(yàn)以及嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，這對(duì)于保證疫苗的安全性及有效性是必要的。目前，全球范圍內(nèi)至少有24種COVID-19滅活疫苗在研發(fā)，其中有15種進(jìn)入臨床研究階段［5］，見(jiàn)表3。在COVID-19滅活疫苗研發(fā)進(jìn)程中，中國(guó)處于全球領(lǐng)先地位，在獲得緊急使用或附條件上市的4種COVID-19滅活疫苗中，中國(guó)占據(jù)其中3種，見(jiàn)表4。

表3 全球進(jìn)入臨床階段的COVID-19候選滅活疫苗Tab.3 Candidate inactivated COVID-19 vaccines in clinical trials worldwide

5.1 北京生物COVI D-19滅活疫苗 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2020年12月30日附條件批準(zhǔn)了北京生物研發(fā)的COVID-19滅活疫苗（BBIBP-CorV）的注冊(cè)申請(qǐng)，在此之前，阿聯(lián)酋和巴林已相繼批準(zhǔn)該疫苗注冊(cè)上市［44］。Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)在中國(guó)河南省進(jìn)行，其中Ⅰ期納入18~80歲健康人群共192人，Ⅱ期納入18~59歲健康人群共448人，BBIBP-CorV在兩個(gè)年齡組的所有試驗(yàn)劑量下安全性和耐受性均良好，在第42天，所有疫苗接種者體內(nèi)均誘導(dǎo)了針對(duì)SARS-CoV-2的體液免疫應(yīng)答［45-46］。Ⅲ期臨床試驗(yàn)為隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的多中心臨床研究，13 086人完成了2劑次注射，自第2劑接種后14 d，累計(jì)確診21例有效病例，疫苗保護(hù)效力為78.1%。接種后7 d內(nèi)嚴(yán)重不良事件59例，報(bào)告發(fā)生率為0.4%，嚴(yán)重不良事件發(fā)生率與僅接種氫氧化鋁佐劑組（嚴(yán)重不良發(fā)生事件78例，報(bào)告發(fā)生率0.6%）相似，顯示出該疫苗良好的安全性［47］。目前，該研究仍在進(jìn)行中，長(zhǎng)期保護(hù)性和安全性仍在評(píng)估中。

5.2 科興生物COVI D-19滅活疫苗 科興生物研發(fā)的COVID-19滅活疫苗克爾來(lái)福?（CoronaVac），于2021年2月6日經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)附條件上市，目前，在32個(gè)國(guó)家授權(quán)緊急使用［48］。該疫苗Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，針對(duì)不同年齡健康人群分別開(kāi)展臨床試驗(yàn)，18~59歲健康人群納入744名志愿者，60歲以上健康人群納入422名志愿者。該公司于2020年6月14日進(jìn)行Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)揭盲，初步結(jié)果顯示，CoronaVac具有良好的安全性和免疫原性［49］。Ⅲ期臨床試驗(yàn)中期結(jié)果表明，該疫苗具有良好的保護(hù)效力，巴西、土耳其、智利還提供了針對(duì)住院病例的保護(hù)效力臨床數(shù)據(jù)。該疫苗對(duì)巴西和土耳其住院病例的保護(hù)效力均為100%；對(duì)智利住院病例的保護(hù)效力為85%。在巴西，CoronaVac預(yù)防癥狀性感染有50.4%的保護(hù)效力，預(yù)防嚴(yán)重病例有100%的保護(hù)效力；安全性方面，接種該疫苗后大多數(shù)不良事件為輕度 ／中度［48，50］。

5.3 武漢生物COVI D-19滅活疫苗 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2021年2月25日批準(zhǔn)了該疫苗附條件上市申請(qǐng)。該疫苗是全球首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的SARSCov-2滅活疫苗。Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)是在18～59歲健康成人中進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)分別納入96和224名志愿者。結(jié)果顯示，不同劑量疫苗組均誘導(dǎo)了高滴度抗體，2劑接種后中和抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生［17］。在阿聯(lián)酋、巴林、秘魯、摩洛哥、阿根廷等國(guó)家進(jìn)行的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，疫苗組完成第2劑注射的志愿者共13 066人，自第2劑接種后14 d，累計(jì)確診26例有效病例；2針免疫程序接種后，中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率超過(guò)99%，針對(duì)由COVID-19的保護(hù)效力為72.8%。接種后7 d內(nèi)嚴(yán)重不良事件64例，報(bào)告發(fā)生率為0.5%，不良事件發(fā)生率與對(duì)照組無(wú)顯著差異,顯示出該疫苗良好的安全性［47］。

5.4 醫(yī)科院生物所COVI D-19滅活疫苗 該疫苗于2020年5月15日正式啟動(dòng)Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)。在Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)評(píng)估了該疫苗在18~59歲健康成人的安全性及免疫原性，Ⅰ期和Ⅱ期分別招募192和750名志愿者［51-52］。Ⅰ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，2劑次接種后，不同劑量組血清轉(zhuǎn)換率均超過(guò)87.5%，未觀(guān)察到與免疫病理相關(guān)的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞［53］。Ⅱ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，不同試驗(yàn)組內(nèi)檢出高滴度的中和抗體和抗S／N蛋白抗體，在研究期間未報(bào)告與疫苗接種相關(guān)的嚴(yán)重不良事件［52］。目前，該種疫苗正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)［5］。

5.5 康泰生物COVI D-19滅活疫苗 該疫苗由深圳康泰生物制品有限公司（簡(jiǎn)稱(chēng)康泰生物）和北京民海生物技術(shù)有限公司研發(fā)的一款SARS-CoV-2滅活疫苗（KCONVAC）。Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)均在18~59歲健康成年人中進(jìn)行，Ⅰ期和Ⅱ期分別招募60和500名志愿者。在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，除了報(bào)道的1例與疫苗無(wú)關(guān)的嚴(yán)重不良事件外，未有其他嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)道，2劑次后，耐受性良好，能夠在健康成人中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的的免疫反應(yīng)，目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)［54］。

5.6 印度Bharat Biotech公司COVI D-19滅活疫苗印度Bharat Biotech公司開(kāi)發(fā)的COVID-19滅活疫苗（BBV152）是進(jìn)入臨床試驗(yàn)的第5種滅活疫苗［55］，也已被批準(zhǔn)在印度緊急使用。在印度11家醫(yī)院進(jìn)行雙盲、多中心、隨機(jī)、對(duì)照的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，排除SARS-CoV-2核酸和／或血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的個(gè)體，共納入375名18~55歲健康成人；Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，BBV152具有可接受的安全性和較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，可產(chǎn)生較高中和抗體滴度，期間報(bào)告了1例與疫苗無(wú)關(guān)的病毒性肺炎的嚴(yán)重不良事件［19，56］。Ⅱ期臨床試驗(yàn)受種人群擴(kuò)大到12~65歲健康人群，共380名志愿者參與；Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示了良好的免疫原性、安全性以及強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，研究中未報(bào)告嚴(yán)重的不良事件［56］。

5.7 其他COVI D-19滅活疫苗 除了上述COVID-19候選滅活疫苗，全球還有多款滅活疫苗正在開(kāi)發(fā)中，包括哈薩克斯坦生物安全問(wèn)題研究所、法國(guó)Valneva公司、伊朗Shifa Pharmed Industrial公司、土耳其Erciyes大學(xué)、泰國(guó)政府制藥組織、日本KM Biologics公司、伊朗防御創(chuàng)新與研究組織等單位研發(fā)的COVID-19滅活疫苗相繼進(jìn)入臨床研究階段，見(jiàn)表4。

表4 緊急使用或附條件上市的COVID-19滅活疫苗Tab.4 Inactivated COVID-19 vaccines for emergency use or conditional marketing

6 對(duì)突變株的保護(hù)作用

隨著大流行持續(xù)蔓延，出現(xiàn)了多種SARS-CoV-2變異株。值得注意的是，最近出現(xiàn)的SARS-CoV-2變異株可能會(huì)影響疫苗保護(hù)效力，而引發(fā)全球公眾擔(dān)憂(yōu)。2020年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的包含D614G的突變株，顯著增強(qiáng)了病毒傳播能力，并逐漸在流行病毒株中占據(jù)主導(dǎo)地位［57］。最近從南非分離的B.1.351變突株在D614G株上引入了進(jìn)一步突變，這些突變可逃避COVID-19康復(fù)者以及一些疫苗受試者的血清中和作用［58］。據(jù)報(bào)道，諾華（Novartis）、強(qiáng)生（Johnson）和阿斯利康（AstraZeneca）生產(chǎn)的COVID-19疫苗針對(duì)B.1.351變突株的保護(hù)作用均有下降［59］。在南非的一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)B.1.351突變株顯著降低了SARS-CoV-2 S蛋白疫苗的保護(hù)效力［14］。突變株的傳播給通過(guò)接種疫苗預(yù)防及控制SARSCoV-2大流行帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，相繼出現(xiàn)的突變株是否影響滅活疫苗的效力同樣令人擔(dān)憂(yōu)。

HUANG等［60］評(píng)估了COVID-19滅活疫苗BBIBPCorV對(duì)突變株的影響，與原始SARS-CoV-2和目前流行的D614G病毒株相比，BBIBP-CorV在很大程度上保留了對(duì)B.1.351突變株的中和作用，這些數(shù)據(jù)表明，B.1.351變突株不能逃脫滅活疫苗誘導(dǎo)的免疫。最近CHEN等［61］評(píng)估了COVID-19滅活疫苗CoronaVac接種者血清對(duì)B.1.1.7，B.1.351，P.1，B.1.429和B.1.526突變株的中和活性，共研究了93份CoronaVac接種者血清，發(fā)現(xiàn)76份（82%）血清樣本能夠中和野生型假病毒，接種后血清中和D614G、B.1.1.7和B.1.429突變株假病毒同樣有效；然而對(duì)B.1.526、P.1、B1.351血清中和效率顯著降低，對(duì)B.1.526血清中和效率降低了4.03倍（95%CI 3.26~4.80），對(duì)P.1降低了3.92倍（95%CI 3.18~4.65），對(duì)最受關(guān)注的南非突變株B1.351降低了5.27倍（95%CI 4.19~6.34）；此外，僅有一小部分疫苗接種后血清能夠中和B.1.526（26%）、P.1（34%）和B.1.351（5%）。

7 COVID-19滅活疫苗的應(yīng)用及面臨挑戰(zhàn)

在COVID-19疫苗研發(fā)中，疫苗企業(yè)同步開(kāi)展生產(chǎn)車(chē)間建設(shè)，對(duì)緩解疫苗安全量產(chǎn)的壓力非常必要。國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物在北京和武漢已經(jīng)建立或正在擴(kuò)建高等級(jí)安全生產(chǎn)車(chē)間，預(yù)計(jì)COVID-19滅活疫苗年產(chǎn)量將超過(guò)40億劑［44，62］。2021年5月7日，WHO總干事譚德塞宣布，北京生物研發(fā)生產(chǎn)的COVID-19滅活疫苗獲得緊急使用授權(quán)，納入全球“緊急使用清單”，為實(shí)現(xiàn)COVID-19疫苗作為全球公共產(chǎn)品特別是在發(fā)展中國(guó)家的可及性和可負(fù)擔(dān)性邁出了重要一步。mRNA疫苗臨床研究的成功，將是疫苗制備技術(shù)的歷史性、革命性突破，但mRNA疫苗本身不穩(wěn)定，需低溫和超低溫運(yùn)輸及儲(chǔ)存，而滅活疫苗4℃條件即能滿(mǎn)足儲(chǔ)存及運(yùn)輸。常規(guī)、成熟技術(shù)、利用現(xiàn)有儲(chǔ)運(yùn)接種系統(tǒng)的滅活疫苗，可及性強(qiáng)，特別適合分發(fā)于發(fā)展中國(guó)家。

多種滅活疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，為日趨嚴(yán)峻的COVID-19疫情防控帶來(lái)希望。滅活疫苗工藝成熟，免疫原性穩(wěn)定，安全性良好，可及性高，但一些關(guān)于滅活疫苗的潛在挑戰(zhàn)也備受關(guān)注：①有報(bào)道COVID-19在老年人和其他疾病患者的死亡率更高［63］，因此滅活疫苗在老年、兒童、基礎(chǔ)性疾病等低免疫力人群的保護(hù)效力備受關(guān)注；②隨著多種SARS-CoV-2突變株的出現(xiàn)，滅活疫苗能否對(duì)突變株具有有效的保護(hù)也備受關(guān)注；③COVID-19康復(fù)期患者血清中產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)，但抗體水平在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值后逐漸降低［64］，提示疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)可能隨時(shí)間延長(zhǎng)而減弱，面對(duì)COVID-19疫情并未減弱的情況下，滅活疫苗的長(zhǎng)期有效性有待進(jìn)一步研究；④滅活疫苗的安全性以及安全生產(chǎn)也至關(guān)重要，2004年有報(bào)道在滅活SARS-CoV后第3天檢測(cè)出活病毒［65］，提示COVID-19滅活疫苗應(yīng)特別需要關(guān)注滅活效果；⑤目前已有多種病毒被觀(guān)察到ADE現(xiàn)象，包括登革病毒、西尼羅河病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、埃博拉病毒等［66］，COVID-19滅活疫苗是否在人體引起ADE也有待進(jìn)一步研究；⑥滅活疫苗通常表現(xiàn)出中等的免疫原性，需要應(yīng)用佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫原性，但佐劑的應(yīng)用通常也增加了不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；⑦滅活疫苗相對(duì)安全穩(wěn)定，但接種1劑通常不產(chǎn)生具有保護(hù)作用的免疫反應(yīng)，且免疫效果維持時(shí)間較短，需多次接種和加強(qiáng)免疫，目前進(jìn)入臨床階段COVID-19滅活疫苗均采用2劑接種策略，COVID-19滅活疫苗最終需要接種幾劑次也有待于進(jìn)一步研究。