新型血紅蛋白攜氧載體OC33抗豬重度失血性休克的有效性研究

臧家濤，李　濤，田昆侖，朱　娛，藍(lán)　丹，彭小勇，劉良明

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·論著·

新型血紅蛋白攜氧載體OC33抗豬重度失血性休克的有效性研究

臧家濤，李濤，田昆侖，朱娛，藍(lán)丹，彭小勇，劉良明

【摘要】目的明確新型血紅蛋白攜氧載體OC33是否具有抗豬重度失血性休克的作用。 方法無特定病原(specified-pathogens free, SPF)級小香豬，雌雄各半，8～10月齡，體重25～30kg。制備50%失血量重度失血性休克豬模型，隨機(jī)分為乳酸林格式液組(LR)，全血組(WB)，OC33低、中、高劑量組(0.1g Hb/kg、0.3g Hb/kg、0.5g Hb/kg)進(jìn)行治療，每組6只。測定組織氧供(DO2)、氧耗(VO2)、血流動力學(xué)、心肌力學(xué)、心輸出量及心功能等指標(biāo)，記錄24h存活率與存活時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以明確OC33是否具有抗豬重度失血性休克的作用。結(jié)果各劑量OC33組模型動物氧供、氧耗、血流動力學(xué)、心輸出量、心肌力學(xué)指標(biāo)(MAP、LVSP、LVEDP、+/-dp/dtmax)、心功能(CO、CI、SI)、存活時(shí)間與存活率等指標(biāo)均優(yōu)于LR組，其中0.5g Hb/kg組效果接近WB組。結(jié)論OC33具有較好的抗豬重度失血性休克的效果。

【關(guān)鍵詞】失血性休克； 攜氧載體； 紅細(xì)胞； 血紅蛋白； 動物模型

作者單位： 400042 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室

基于血紅蛋白的攜氧載體(hemoglobin based oxygen carriers,HBOCs)具有與紅細(xì)胞相近的攜氧性質(zhì)，沒有傳統(tǒng)輸血方式面臨的血型復(fù)雜、輸血感染、儲存期短、血源枯竭等問題，近幾十年來一直是眾多科研工作者的研究目標(biāo)，可用于戰(zhàn)場和院前急救，特殊情況下代替紅細(xì)胞，改善血管栓塞患者重要器官缺氧，腫瘤治療等領(lǐng)域[1-3]。前期研制的HBOCs產(chǎn)品可分為二代，其中第一代HBOC產(chǎn)品導(dǎo)致急性腎功能衰竭、死亡率升高等嚴(yán)重不良反應(yīng)，很快被淘汰；第二代HBOC產(chǎn)品在技術(shù)工藝、理論方法等方面有顯著進(jìn)步，多種產(chǎn)品進(jìn)入Ⅲ期臨床階段，其作為紅細(xì)胞代用品的有效性得到證實(shí)，但仍存在一定的心肌梗死、血壓升高等心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)，最終未能正式獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用[4]。目前，科研工作者們正在研究新的技術(shù)方法，包括提高血紅蛋白(hemoglobin,Hb)純度的方法，更理想的Hb分子內(nèi)及分子間交聯(lián)的方法，控制Hb氧化損傷的方法等[5-7]，爭取早日開發(fā)出效果更好、毒性更低、臨床可用的第三代HBOC產(chǎn)品。

香港新意康生物科技有限公司近年來一直致力于新一代HBOC的開發(fā)，經(jīng)過多次工藝改進(jìn)開發(fā)出了代號為OC33的產(chǎn)品。OC33是由牛Hb αβ二聚體經(jīng)雙阿司匹林分子內(nèi)交聯(lián)制備成分子量64千道爾頓(kDa)的Hb(αβ)2四聚體，再加入抗氧化劑、穩(wěn)定劑、緩沖鹽等制成。本實(shí)驗(yàn)室前期受新意康生物科技有限公司委托，通過重度失血性休克模型大鼠對OC33進(jìn)行了初步評價(jià)，結(jié)果顯示OC33具有較好的抗大鼠重度失血性休克的效果。為進(jìn)一步明確OC33的抗休克作用，有必要利用重度失血性休克大動物模型進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，以全面評價(jià)OC33作為新一代HBOC在抗重度失血性休克方面的效果。為此，本研究選取小型豬作為實(shí)驗(yàn)動物制備重度失血性休克模型，重點(diǎn)評估OC33改善缺氧狀態(tài)、恢復(fù)心血管系統(tǒng)功能、提高存活率等方面的有效性，為后期進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

材料與方法

1主要儀器與試劑

OC33由香港新意康生物科技有限公司提供，Hb濃度6～7g/dL，含N-乙酰半胱氨酸、Ringer’s醋酸鹽及K+、Na+、Cl-，滲透壓約300mOsm。

乳酸林格氏液(四平巨能藥業(yè)有限公司)；肝素鈉生理鹽水(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司)；注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；全血，失血性休克模型小型豬自體。

血流動力學(xué)測定儀、心輸血量測定儀(Power Lab，澳大利亞)，PF5010激光多譜勒組織血流量測定儀(Perimed，瑞士)，MVIS-2020血液流變學(xué)測定儀(重慶天海醫(yī)療設(shè)備公司)，Phox plusl血?dú)夥治鰞x(Nova，美國)，微量注射式輸液泵(B.Braun, 德國)。

2動物模型[7]

無特定病原(specified-pathogens free, SPF)級小香豬，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雌雄各半，8～10月齡，體重25～30kg。實(shí)驗(yàn)前1d禁食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日先用氯胺酮誘導(dǎo)麻醉，再腹腔注射質(zhì)量體積比(m/V)3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。右側(cè)股動脈、股靜脈插管，插管完成后經(jīng)股脈注射500U/kg肝素鈉生理鹽水抗凝；股動脈插管經(jīng)三通管連接水銀血壓計(jì)，供觀測血壓和放血，股靜脈插管用于給藥。按55mL/kg計(jì)算豬全血量(whole blood,WB)，各組以約6mL/(kg·min)的速度按照50%失血量進(jìn)行放血。放血完畢，用輸液泵先輸注等失血量體積乳酸林格氏液(Ringer’s solution，LR)，然后按實(shí)驗(yàn)分組分別輸注LR、WB和OC33進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇、測試完畢，拔出股動、靜脈插管并進(jìn)行結(jié)扎，縫合傷口后給予注射用青霉素鈉7×104U/kg，注射用硫酸鏈霉素1×105U/kg。治療結(jié)束，將動物送回實(shí)驗(yàn)動物中心，限量飲食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)完成，存活的豬在麻醉狀態(tài)下，通過靜脈快速注射10%的氯化鉀溶液(0.3～0.5mL/kg)處死。

3實(shí)驗(yàn)分組

30只小香豬根據(jù)體重分批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使同批次動物體重差別<1kg；每批次動物隨機(jī)分配至表1所示的分組，雌雄各半，每組6只。

表1　實(shí)驗(yàn)動物分組(每組6只)

模型制備完成，所有模型動物先通過注射泵輸注等失血量體積LR，然后各組按照表1所示劑量通過右股靜脈給藥，各組自放血完畢至治療完畢所輸液體總體積為2倍失血量體積，OC33各劑量組給藥體積與失血量體積相比較不足的部分用LR補(bǔ)足；LR、WB、OC33輸注速度分別為250、200、50mL/h。治療完畢觀察24h存活率、存活時(shí)間。

4指標(biāo)測量

另取40只小香豬按表1的方法分組，按上述相同方法進(jìn)行模型制備，按上述方法治療，在模型制備前后，藥物治療0.5、1、2、3h等6個(gè)時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)測定：通過股動脈插管連接的水銀血壓計(jì)測定平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)；1分鐘計(jì)數(shù)法記錄呼吸頻率(respiration rate,RR)；右頸總動脈插管至左心室，連接血流動力學(xué)測定儀測定心率(heart rate,HR)、左室收縮峰壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓力最大上升/下降速率(the maximum rate of left ventricular pressure rise/drop,±dp/dtmax)；左股靜脈插飄浮導(dǎo)管，連接心輸血量測定儀測定心輸出量，計(jì)算心排量(cardiac output,CO)、心臟指數(shù)(cardiac index,CI)、每搏量指數(shù)(stroke index,SI)等心功能指標(biāo)及組織氧供(oxygen delivery,DO2)、氧耗(oxygen uptake,VO2)。

5數(shù)據(jù)分析

用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間采用單因素或雙因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組間比較采用q檢驗(yàn)(P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著)。

結(jié)果

1OC33復(fù)蘇對重度失血性休克豬RR、MAP、HR的影響

休克后各組RR值均增加，復(fù)蘇后有所降低(圖1a)，與Ⅳ組比較差異不顯著。休克后各組MAP均顯著降低，復(fù)蘇后MAP均不同程度升高；與Ⅳ組比較，各劑量組OC33都能顯著升高M(jìn)AP，而Ⅰ組甚至高于Ⅴ組(圖1b)，顯示OC33具有較顯著的升高血壓的作用。休克和復(fù)蘇后各組豬的HR變化不明顯，同一時(shí)相點(diǎn)HBOC各組與全血組比較總體無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1c)，表明OC33對心臟節(jié)律沒有明顯影響。

2OC33復(fù)蘇對重度失血性休克豬心肌力學(xué)的影響

Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅴ組實(shí)驗(yàn)動物復(fù)蘇后LVSP值快速顯著升高，2、3h時(shí)相點(diǎn)LVSP值與Ⅳ組比較差異顯著，Ⅲ組動物L(fēng)VSP有輕度升高但無顯著差異；Ⅰ組、Ⅱ組實(shí)驗(yàn)動物復(fù)蘇后LVSP值略高于Ⅴ組(圖2a)，表明OC33可快速改善心臟功能，提高左室收縮壓力。與Ⅳ組相比，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組動物復(fù)蘇后±dp/dtmax值均有所升高，其中I組給藥后各時(shí)相點(diǎn)±dp/dtmax值顯著升高(圖2b、c)，表明0.5g Hb/kg OC33對重度失血性休克豬心肌收縮有明顯改善作用。

3OC33復(fù)蘇對重度失血性休克豬心功能的影響

與Ⅳ組相比，復(fù)蘇后Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組動物的心功能指標(biāo)CO、CI、SI均不同程度升高，其中Ⅰ組升高最顯著且與Ⅴ組接近(圖3)，表明OC33對重度失血性休克豬心功能有明顯的恢復(fù)作用。

4OC33復(fù)蘇對重度失血性休克豬氧供、氧耗影響

與Ⅳ組相比，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組動物復(fù)蘇后DO2、VO2均不同程度增加，其中Ⅰ組變化最顯著(圖4)，表明OC33能夠增加組織氧的供應(yīng)，恢復(fù)缺血組織、細(xì)胞代謝水平。

5OC33復(fù)蘇對重度失血性休克豬存活率、存活時(shí)間的影響

Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組模型動物24h存活率、存活時(shí)間均高于Ⅳ組，其中Ⅰ組數(shù)據(jù)接近Ⅴ組，顯示OC33較LR療效更好，與全血接近(表2)。

abc

與Ⅳ組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1OC33對重度失血性休克豬RR、MAP、HR的影響

abc

與Ⅳ組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2OC33對重度失血性休克豬心肌力學(xué)的影響

abc

與Ⅳ組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3OC33對重度失血性休克豬心功能的影響

ab

與Ⅳ組比較：*P<0.05，**P<0.01

與Ⅳ組比較：*P<0.05，**P<0.01

討論

當(dāng)前臨床常用的重度失血性休克早期急救復(fù)蘇液體是乳酸林格氏液，其療效較差，因此血液代用品的研究意義重大。理想的血液代用品應(yīng)是兼具紅細(xì)胞、血小板、白蛋白功能的等張等滲溶液，但受理論、技術(shù)條件的限制，在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)人類將只能先行研制具備血液最重要的氧氣運(yùn)輸功能的血液代用品——紅細(xì)胞代用品，而通過對比既有紅細(xì)胞代用品全氟碳與HBOC的實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)，HBOC更有前景[8-9]。截止目前為止，已經(jīng)開發(fā)了兩代HBOC產(chǎn)品，其中多種第二代HBOC產(chǎn)品進(jìn)入III期臨床實(shí)驗(yàn)階段，還曾經(jīng)在艾滋病問題嚴(yán)重的非洲地區(qū)作為手術(shù)用血，已經(jīng)非常接近正式臨床應(yīng)用[10]。當(dāng)前HBOC研究領(lǐng)域面臨的主要問題是減輕或消除其不良反應(yīng)，尤其是對心血管系統(tǒng)的不良反應(yīng)[11]。目前已經(jīng)有研究者提出了一些針對血紅蛋白氧化活性、NO消耗問題的技術(shù)方案，在實(shí)驗(yàn)室研究階段取得了一些初步的成果[12]，香港新意康生物科技有限公司也研制了新型HBOC產(chǎn)品-OC33。相信在眾多科研工作者的不懈努力下， HBOC正式進(jìn)入臨床應(yīng)用的時(shí)刻將很快到來。

本研究在前期小動物模型試驗(yàn)基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)用小香豬作為大動物模型，對香港新意康生物科技有限公司研制的OC33治療重度失血性休克的有效性進(jìn)行進(jìn)一步研究。研究結(jié)果表明，OC33能有效升高重度失血性休克豬的血壓，降低呼吸頻率和心率，提高存活率并延長存活時(shí)間，這些大體指標(biāo)的改善證實(shí)了OC33治療重度失血性休克的有效性，其0.5g Hb/kg劑量的療效接近甚至在某些指標(biāo)上超過全血。OC33對于心功能、心肌力學(xué)、組織氧供和氧耗等參數(shù)的改善提示其能迅速發(fā)揮攜氧、擴(kuò)容的作用，防止重要臟器由于血容量降低、紅細(xì)胞丟失發(fā)生缺血、缺氧，這也是其效果優(yōu)于目前臨床常用的乳酸林格氏液的主要原因。至于OC33是否有效地降低或避免了毒副作用，還需要通過急性、慢性毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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·臨床問答·

問題1： 什么是肘關(guān)節(jié)“恐怖三聯(lián)征”以及治療原則？

解答：肘關(guān)節(jié)恐怖三聯(lián)征(terrible triad of the elbow)是指肘關(guān)節(jié)后脫位同時(shí)伴有橈骨頭和尺骨冠突骨折，常發(fā)生于高能量損傷。1996年由Hotchkiss首先將此種損傷獨(dú)立提出并命名。治療原則：肘關(guān)節(jié)恐怖三聯(lián)征嚴(yán)重破壞肘關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，非手術(shù)治療效果差，治療原則是首選手術(shù)治療，使用鋼板和(或)螺釘內(nèi)固定結(jié)合鉸鏈?zhǔn)酵夤潭苤委?，可以取得較為良好的效果。治療中注意觀察上臂及肘部有無神經(jīng)血管損傷，尤其是注意觀察和處理骨筋膜室綜合征。

(李繼慶解放軍477醫(yī)院骨科，湖北 襄陽410210)

【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.02.009

Effect of a new hemoglobin based oxygen carrier OC33 in severe hemorrhagic shock of pigs

ZANGJia-tao,LITao,TIANKun-lun,ZHUYu,LANDan,PENGXiao-yong,LIULiang-ming

(Department 2,Institute of Surgery Research,Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing400042,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the hemoglobin based oxygen carrier,OC33,in severe hemorrhagic shock in pig models. MethodsEighteen severe hemorrhagic shock pig models (9 male pigs and 9 females pigs of 8-10 years weighted from 25-30kg) were prepared from specified pathogens free (SPF) pigs by controlled blood depleting of 50% whole blood volume. And then model pigs were randomly divided into three groups,Ringer’s solution team (LR),whole blood group (WB) and OC33 group. Model pigs were treated with corresponding solutions,and indexes including tissue oxygen delivery (DO2) and uptake (VO2),blood kinetics and myocardial kinetics,cardiac output and cardiac function were tested. Model pigs were sent back to observation ward after remedy and 24 hour survival time and survival rate were recorded. Statistical analysis was done to evaluate whether OC33 could be used in severe hemorrhagic shock pig remedy. ResultsIndexes including DO2,VO2,blood kinetics,heart output,myocardial mechanic parameters(MAP，LVSP，LVEDP，+/-dp/dtmax ),heart function parameters(CO，CI，SI),survival rate and time of the OC33 group were better than those in the LR group. The 0.5g Hb/kg group had the best effect among the three OC33 groups,some indexes of this group were even similar with those of the WB group. ConclusionOC33 is a good candidate in severe hemorrhagic shock remedy for pig models.

【Key words】hemorrhagic shock; oxygen carrier; red blood cell; hemoglobin; animal model

(收稿日期：2015-07-13； 修回日期： 2015-09-07)

通訊作者：劉良明，E-mail:liangmingliu@yahoo.com

【中圖分類號】Q513; Q939.48; R394-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

文章編號：1009-4237(2016)02-0094-04